高效液相色谱法测定枸橼酸托法替布含量

●孙垚峰

高效液相色谱法测定枸橼酸托法替布含量

●孙垚峰

目的：建立高效液相色谱法测定枸橼酸托法替布含量。方法：以0.1%醋酸溶液-甲醇-乙腈（60：35：5）流动相A，以甲醇-0.1%醋酸溶液-乙腈（80：15：5）流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为250nm，柱温40℃。结果：枸橼酸托法替布在质量浓度为50-70ug/ml范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9995；平均回收率为99.9%。结论：该方法简单、准确、无干扰，可用于枸橼酸托法替布的含量测定。

高效液相色谱法；方法学验证；枸橼酸托法替布；含量测定

枸橼酸托法替尼是美国辉瑞公司研发的一种新型Janus 激酶抑制剂，2012 年11 月经美国FDA 批准上市，商品名Xeljanz[1]。该药用于对氨甲喋呤治疗应答不充分或不耐受的中至重度活动性类风湿关节炎的成人患者，是一种新型口服JAK 抑制剂[2]。

本研究综合相关文献[3-5]。目前化学药品含量的主要测定方法有，滴定法、比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱法等。本文采用高效液相色谱法测定枸橼酸托法替布的含量，该方法简单、准确、无干扰，重复性好，可用于枸橼酸托法替尼含量的控制。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

2.3 专属性实验

取空白辅料、枸橼酸托法替布片按照2.2.2方法配制辅料空白溶液、供试品溶液，先进空白溶液，再进供试品溶液，结果显示无溶剂峰、辅料峰干扰测试。

试验结果如下图1所示：

2.4 线性及范围

2.4.1 精密称取枸橼酸托法替布对照品，加溶剂溶解并稀释制成每1ml约含枸橼酸托法替布0.3mg的溶液，作为线性储备液；精密量取线性储备液 1.6ml、1.8ml、2.0ml、2.2ml、2.4ml分别置 10ml容量瓶中，加溶剂稀释定容至刻度，摇匀，分别作为线性溶液①、②、③、④、⑤，包括80%规格、90%规格、100%规格、110%规格、120%规格，作为线

图1

Thermo Ultimate3000型高效液相色谱仪；XP56梅特勒-托利多电子分析天平；实验室专用超纯水机。

枸橼酸托法替尼（辉瑞公司；规格5mg★60片）；枸橼酸托法替布对照品（120109-178146；中国生物制品检定所）；乙腈、甲醇，色谱纯（美国MERCK公司）；醋酸，分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 流动相：流动相A为0.1%醋酸溶液-甲醇-乙腈（60：35：5），流动相B为甲醇-0.1%醋酸溶液-乙腈（80：15：5），按下表进行梯度洗脱：

2.1.2溶剂：水-甲醇-乙腈（60:35:5）

2.1.3 采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，检测波长为250nm，柱温为40℃，流速为每分钟1.0mL，自动进样器5℃，进样体积为10μl，理论板数按托法替布峰计应不低于3500；

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液：取枸橼酸托法替布对照品约24mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，精密量取对照品储备液5ml，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含60ug的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液：取枸橼酸托法替布20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于枸橼酸托法替布6mg），置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。性回归点。以浓度（ug/ml）为横坐标，托法替布峰面积的为纵坐标，得出线性方程线性方程，计算相关系数，结果见表1，线性回归的相关系数（r）在≥0.999范围内，证明方法线性良好（如图2）。

表一

2.5 进样精密度试验

精密吸取2.2.2项下溶液，按2.1项下色谱条件，考察连续进样6针对照品检测结果的接近程度，结果托法替布峰面积RSD为0.1%，证明该方法重复性良好。

2.6 重复性试验

取供试品，按2.2.2项下方法平行配制6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，结果枸橼酸托法替布含量平均值（n=6）RSD为0.6%，证明该方法重复性良好。

试验结果如下图3所示：

2.7 准确度

以2.2.2中规定的样品配制浓度为100%规格，分别准确称枸橼酸托法替布对照品，加空白辅料上适量，加溶剂使枸橼酸托法替布溶解，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，每个浓度（包括80%规格、100%规格、120%规格）各配制3份，共9份溶液。按含量测定方法，每份供试品溶液进样1针，计算9份溶液枸橼酸托法替布的回收率（n=9）RSD为0.5%，证明该方法回收率良好。

图2 （线性及范围）

图3 （重复性试验）

试验结果如表2。

表2

2.8 耐用性试验

改变柱温、醋酸加入量以及改变色谱柱，供试品含量均在95.0%～105.0%之间，RSD分别为0.3%、0.2%、0.2%，正常条件与改变条件含量RSD为0.3%，证明该方法耐用性良好。

2.9 溶液稳定性试验

2.9.1 对照品溶液 5℃条件下放置 0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、48h后分别进样1针，记录色谱图。托法替布峰面积的RSD为0.2%。

2.9.2 供试品溶液在5℃条件下放置0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、48h后分别进样1针，记录色谱图。含量在95.0%～105.0%之间，RSD为0.3%，证明该方法溶液稳定性较好。

3 结论

通过以上方法学实验证明该方法简单、准确、无干扰，可用于枸橼酸托法替布的含量测定。

（作者单位：正大天晴药业集团股份有限公司）

[1] 赵方露, 陈国华, 姚世伦等. 枸橼酸托法替尼的合成[J]. 中国医药工业杂志,2014,45(3):201-204.

[2] 王铁英. 托法替尼柠檬酸盐( Tofacitinib) [J]. 中国药物化学杂志，2013,23(2):166-167.

[3] 刘二东,宋春霞,刘冉冉等. 高效液相色谱法测定含乳饮料中苯甲酸的含量[J].化学工程师,2009,23 (4):29-30,48.

[4] 陈娇婷,詹怡飞. HPLC法枸橼酸托法替布的含量[J].中国民族民间医药，2015,24 (17):23-24.

[5] 王转,尹东东,王杏林,詹璐璐. 高效液相色谱法在手型药物分析中的研究进展[J].药物分析杂质，2015,35(7):1127-1133.