精子-透明质酸结合试验与不明原因不孕患者行宫内人工授精后妊娠结局的关系

邱孙全，王金香

（浙江大学医学院附属妇产科医院，浙江 杭州310006）

精子-透明质酸结合试验与不明原因不孕患者行宫内人工授精后妊娠结局的关系

邱孙全，王金香

（浙江大学医学院附属妇产科医院，浙江 杭州310006）

目的 探讨精子-透明质酸结合试验（HBA）与不明原因不育患者行宫腔内人工授精（IUI）后妊娠结局的关系。方法 根据HBA测量值将238例不明原因不孕行IUI的患者分为A组（HBA≥65%）108例和B组（HBA＜65%）130例，并比较不同水平的HBA的临床妊娠率、流产率、活产率等妊娠结局。 结果 A组周期妊娠率（16.7%）高于B组（13.9%），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；两组流产率和活产率差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论HBA结合率高，不明原因不孕患者行IUI所获得的妊娠率也较高，但与流产和活产率没有明显关系。

精子-透明质酸结合试验；不孕；宫腔内人工授精；妊娠结局

精液的精子密度、活力和形态是评定男性因素不育的常规检查指标，但部分临床诊断为不明原因不育的患者，其精子常规检测结果正常，其他多种常规辅助检查结果也均为阴性。促排卵+宫腔内人工授精（IUI）是对此类患者较好的临床治疗策略［1］。但IUI技术仍需依赖两性配子的自然受精能力，如果存在精子与卵子透明带的结合障碍，IUI就可能失败。本研究通过使用人精子-透明质酸结合试验（human sperm-hyaluronan acid bindingassay，HBA），分析精子-透明质酸结合能力与不明原因不育患者行IUI后妊娠结局的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年7月～2015年5月，在本院生殖内分泌科进行的1057例夫精人工授精（artificial insemination with husband sperm，AIH）周期的临床资料，其中不明原因不孕不育有238例，女方各项生殖功能检查正常，经输卵管造影证实至少有一侧输卵管通畅；其男性精液常规参数检测均为正常水平（精子密度＞20×106/mL，前向运动精子＞25%，正常形态精子＞4%），临床诊断为：不明原因不孕不育症。根据此前的研究，作者对体外受精-胚胎移植周期的患者其体外受精率是否≥70%为分类因变量作ROC曲线，获得HBA结合率的最佳分界点65%［2］。以此分界点将238例不明原因不孕不育病例样本分为A组 （HBA结合率≥65%）108例和B组（HBA结合率＜65%）130例，两组男方年龄、女方年龄、不孕年限、体质量指数（BMI）、卵泡数及子宫内膜厚度差异均无统计学意义 （均P＞0.05）。详见表1。

表1 两组一般资料比较（±s）

表1 两组一般资料比较（±s）

组别 n 年龄（岁）男女不孕年限（年） BMI（kg/m2） 卵泡数（个） 子宫内膜厚度（mm）A组 108 32.5±4.8 30.7±3.9 3.1±1.6 20.8±3.1 2.3±2.0 10.0±1.8 B组 130 32.0±4.3 30.3±3.9 3.2±2.0 20.8±2.4 2.1±1.6 10.0±2.0

1.2 方法

1.2.1 HBA试验 试剂盒来自深圳博锐德生物科技有限公司。将10μL液化的精液加入透明质酸包被载玻片的“T”孔中，盖上盖玻片后待精液自然扩散到“C”孔（对照孔）；室温放置10分钟后，在200倍显微镜下观察精子与HBA玻片上的透明质酸结合情况，计算精子-透明质酸结合率（%）=［（“T”孔被结合精子数/“T”孔被结合精子总数-“C”孔被结合精子数/“C”孔被结合精子总数）×100%］。

1.2.2 卵泡监测和人工授精时机 自然周期的患者于月经周期的第12天开始行经阴道超声检测。控制性超促排卵患者采用人绝经期促性腺激素（HMG）/人绒毛膜促性腺激素（HCG）、来曲唑（LE）/ HMG方案。阴道超声动态监测卵泡的发育（卵泡直径≥14mm为优势卵泡）及子宫内膜的厚度和类型。当促黄体生成激素（LH）峰出现或卵泡平均直径达18mm时，肌肉注射HCG 5000～10000IU，在注射HCG后24～48小时内行人工授精，每周期行单次或双次AIH治疗。

1.2.3 精液处理 男方禁欲3天后，采用手淫法取精，待精液液化后，参考《WHO第五版人类精液检验和处理手册》［3］观察精子密度和活动力，然后取1～2mL精液进行密度梯度离心并重悬收集活力精子用于人工授精。

1.2.4 授精方法 女方取膀胱截石位，暴露宫颈后，用1mL注射器吸取经过处理的精子悬液0.3～0.5mL，与人工授精管相连，缓慢注入宫腔内，抬高臀部保持仰卧位约20分钟。术后常规黄体支持。4周后行B超检查，如见妊娠囊，则确定为临床妊娠。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计分析。计量资料数据采用（±s）表示，组间比较采用两组独立样本t检验，率的比较采用χ2检验。

2 结果

A组成功妊娠18例，活产14例，流产4例；B组成功妊娠18例，活产13例，流产3例，宫外孕2例。A组的周期妊娠率16.7%（18/108）较B组13.9% （18/130）高，差异具有统计学意义（P＜0.05），而两组间流产率和活产率差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表2。

表2 两组妊娠结局的比较（n，%）

3 讨论

本研究通过根据HBA结合率的分组比较，首次发现HBA结合率与不明原因不孕患者行IUI周期妊娠率有关，HBA检测值≥65%者可以获得更高的周期妊娠率（P＜0.05）。表明HBA结合率对于此类患者行IUI的成功率具有提示作用。对于临床上选择最佳的辅助生殖技术有一定的参考意义。

精子在发育过程后期形成透明质酸（hyaluronic acid，HA）结合位点。透明质酸是卵丘复合物中颗粒细胞基质的主要组成部分，两者的结合在受精过程中起重要作用。HA与精子发育过程中的细胞凋亡、DNA碎片化、非整倍体染色体形成以及成熟度等情况有关。Cayli等［4］发现HA结合精子有着较低的caspase-3激活水平，而caspase-3是细胞内一个重要的凋亡因子，表明与HA结合的精子有着更低的凋亡水平。Huszar等［5］发现了一系列精子成熟的分子标志物，并且通过研究发现HA与精子中CK和HspA2的水平具有相关性，进一步实验揭示了与HA结合的均为成熟精子。HA与精子DNA碎片化的相关性也被多项研究证实［6］。Jakab等［7］发现精子经过HA选择后，其正常形态精子率提高了3倍。这些研究表明与HA结合的精子具有较好的质量及成熟度。因此，通过HBA试验检测精子与固相HA的结合能力，可以反映精子的质量，可能与精卵结合、胚胎早期卵裂发育以及妊娠结局有关。

目前，HBA与受精及临床妊娠结局的相关性研究报道并不多，研究结果也不尽相同。Ye等［8］对175例常规IVF周期样本研究发现HBA结合率与体外受精率显著相关，作者也报道过类似的结果［3］。而Nijs等［9］研究结果显示HBA与受精率并无相关性，却发现HBA与妊娠率显著相关。Tarozzi等［6］研究报道HBA与体外受精率及临床妊娠率均无相关性。Boynukalin等［10］研究结果提示HBA结合率并不能提示临床妊娠率。本组结果提示，HBA结合率较高的A组，其周期妊娠率也较高，而与流产率和活产率没有明显关系。

不明原因不孕的可能潜在因素包括卵泡发育不良、精卵结合障碍、子宫内膜因素、输卵管捡拾和运送卵子功能异常、黄素化未破裂卵泡综合征、不良的宫颈分泌物影响、轻度子宫内膜异位症及免疫因素等。因其病因复杂和不确定性而没有最佳治疗方案。目前主要的治疗方案为促排卵同房或IUI，认为经3个周期的IUI治疗未获成功者，建议进入IVF-ET周期。本研究结果显示HBA结合率与不明原因不孕患者行IUI后的临床妊娠率有关，表明HBA结合率对于此类患者行IUI的成功率具有提示作用，为选择合适的辅助生殖技术提供新思路，并有助于进一步阐明此类患者的不孕机制，最终提高妊娠率。

［1］ Veltman-verhulst SM，Hughes E，Ayeleke RO，et al.Intrauterine insemination for unexplained subfertility.Cochrane Database Syst Rev，2016，2:CD001838

［2］王金香，邱孙全，叶英辉，等.人精子-透明质酸结合试验与IVF-ET结局相关性研究.生殖与避孕，2015，35（4）:247

［3］ WHO.Laboratory manual for the examination and processing of human semen（fifth edition）.WHO Press，2010：7

［4］Cayli S，Jakab A，Ovari L，et al.Biochemical markers of sperm function:male fertility and sperm selection for ICSI.Reprod Biomed Online，2003，7（4）:462

［5］ Huszar G，Ozenci CC，Cayli S，et al.Hyaluronic acid binding by human sperm indicates cellular maturity，viability，and unreacted acrosomal status.Fertil Steril，2003，79（Suppl 3）:1616

［6］Tarozzi N，Nadalini M，Bizzaro D，et al.Sperm-hyaluronanbinding assay:clinical value in conventional IVF under Italian law.Reprod Biomed Online，2009，19（Suppl 3）:35

［7］Jakab A，Sakkas D，Delpiano E，et al.Intracytoplasmic sperm injection:a novel selection method for sperm with normal frequency of chromosomal aneuploidies.Fertil Steril，2005，84 （6）:1665

［8］Ye H，Huang GN，Gao Y，et al.Relationship between human sperm-hyaluronan binding assay and fertilization rate in conventional in vitro fertilization.Hum Reprod，2006，21 （6）:1545

［9］Nijs M，Creemers E，Cox A，etal.Relationship between hyaluronic acid binding assay and outcome in ART:a pilot study.Andrologia，2010，42（5）:291

［10］Boynukalin FK，Esinler I，Guven S，et al.Hyaluronan assay does not predict pregnancy rates in IUI cycles in couples with unexplained infertility.Arch Gynecol Obstet，2012，186 （6）:1577