激光免疫疗法对多发性皮肤鳞状细胞癌小鼠的抗肿瘤效应研究

罗敏 石磊 张付贺 陈伟 王秀丽

200443 上海，安徽医科大学上海皮肤病临床学院（罗敏、张付贺、王秀丽）；上海市皮肤病医院、同济大学医学院光医学研究所（石磊、陈伟）

激光免疫疗法对多发性皮肤鳞状细胞癌小鼠的抗肿瘤效应研究

罗敏 石磊 张付贺 陈伟 王秀丽

200443 上海，安徽医科大学上海皮肤病临床学院（罗敏、张付贺、王秀丽）；上海市皮肤病医院、同济大学医学院光医学研究所（石磊、陈伟）

目的探讨激光免疫疗法对多发性皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）小鼠的抗肿瘤效应。方法用紫外线持续照射SKH⁃1无毛小鼠建立免疫功能正常的小鼠多发性皮肤鳞癌模型后，分成激光免疫组、激光组、咪喹莫特组和对照组（每组5只）。激光免疫组：联合外用咪喹莫特乳膏及808 nm激光照射；激光组：仅予808 nm激光照射；咪喹莫特组：仅予咪喹莫特乳膏外用；对照组不予任何处理。治疗后记录小鼠瘤体体积、生存情况和肿瘤形态学变化。第27、60天用t检验和Mantel⁃Cox logrank检验两两比较4组小鼠背部瘤体体积和生存率。另取12只鳞癌小鼠分成4组，每组3只，治疗后第5天，取瘤体组织进行病理学观察。结果第27天时，对照组和咪喹莫特组瘤体体积均较治疗前明显增大（均P＜0.05），激光组和激光免疫组瘤体无明显增大（均P＞0.05），其中咪喹莫特组瘤体体积略小于对照组（P＞0.05），而激光组和激光免疫组瘤体体积明显小于对照组（均P＜0.05）。第60天时激光组瘤体体积增大，体积明显大于激光免疫组（P＜0.05）。对照组小鼠在40 d内全部死亡；咪喹莫特组小鼠在50 d内全部死亡；激光组小鼠在第52、53天分别死亡1只，余存活60 d以上；激光免疫组小鼠在60 d内无死亡。第60天与对照组比较，咪喹莫特小鼠生存时间稍有延长，差异无统计学意义（P＞0.05）；激光组和激光免疫组小鼠生存时间明显延长（均P＜0.05），但激光免疫组与激光组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。组织病理学显示咪喹莫特外用5 d无细胞死亡，而激光组及激光免疫组细胞大量死亡，瘤周可见多种炎症细胞，较对照组明显增多，尤以激光免疫组更明显。结论激光免疫疗法是一种安全且有效的治疗皮肤鳞癌方法，尤其对多发性或转移性皮肤鳞癌具有潜在价值。

肿瘤，鳞状细胞；激光；免疫；小鼠

皮肤鳞状细胞癌（简称鳞癌）是常见的皮肤肿瘤之一。皮肤鳞癌病因复杂，长期紫外线照射是最主要的诱因之一［1］。手术、放疗、化疗等传统方法治疗鳞癌存在不良反应大、治疗后容易复发、复发后再次治疗困难等问题，尤其是多发性及转移性鳞癌的治疗非常棘手，亟需开发新的治疗方法［1⁃2］。激光免疫疗法是一种肿瘤治疗方法，通过联合光热治疗和免疫佐剂协同发挥抗肿瘤作用［3］，目前已在晚期转移性乳腺癌和皮肤黑素瘤的临床治疗中取得了较为理想的疗效［4⁃5］。本研究以紫外线诱导的多发性皮肤鳞癌小鼠为动物模型，初步研究激光免疫疗法对多发性皮肤鳞癌小鼠的抗肿瘤作用。

资料与方法

一、资料

1.动物：SKH⁃1无毛小鼠，具有完整的免疫系统。从美国Jackson实验室引进，由复旦大学上海市公共卫生中心清洁级动物饲养室负责繁殖和饲养（许可证号SCXK沪2015⁃0002），室温20～24℃，给予标准颗粒饲料和水饲养。实验选择6～8周龄的雌性小鼠。

2.仪器与试剂：SS⁃03B型UV⁃B光疗仪（只含10%UVB和90%UVA）、UVB辐照计（上海希格玛高技术有限公司）。半导体激光器，波长为808 nm（FC⁃W⁃808⁃20w⁃13565，长春新产业光电技术有限公司），微透镜光纤（Batch：ML0210，美国 Pioneer Optics公司）。5%咪喹莫特乳膏（0.25 g：12.5 g，四川明欣药业有限责任公司）。

二、方法

1.紫外线诱导多发性皮肤鳞癌小鼠模型的建立：SS⁃03B型UV⁃B光疗仪开机后待输出功率稳定，每次取5只小鼠，暴露于上述光源下进行照射，照射光源距小鼠背部皮肤垂直距离30 cm，光线覆盖小鼠整个背部。不照射期间正常饲养。照射起始剂量依据最小红斑量（MED）决定，即采用自制MED测量板［6］，选择3只SKH⁃1小鼠进行检测，照射光源距小鼠背部皮肤垂直距离30 cm，观察不同剂量紫外线照射1次后24 h照射部位的皮肤反应，出现肉眼可见红斑的最小照射剂量即为MED值。照射剂量为第1、2周采用90%MED剂量照射，每周连续照射5次，第3周按每两周增加15%MED，第9周按每两周增加7.5%MED，第11周后维持剂量至实验结束。照射期间仔细观察小鼠皮肤变化，根据本课题组既往研究［6］，小鼠瘤体直径达1～4 mm且持续存在2周以上建模成功。

2.实验分组及处理：取20只成功建模的鳞癌小鼠，分为激光免疫组、激光组、咪喹莫特组和对照组（每组5只）。激光免疫组：第1～3、5～7天予局部外涂咪喹莫特乳膏，每天1次，第4天予808 nm近红外激光照射（1 W/cm2，10 min），激光免疫组治疗1次疗程为7 d，每次治疗间隔为7 d，共治疗3次。照光治疗：通过微透镜光纤对小鼠背部肿瘤进行非侵入性照射，功率密度为1 W/cm2，照射时间为10 min，光斑面积以覆盖肿瘤周围2～5 mm为准。激光组：仅在第4、18、32天给予808 nm激光照射（1 W/cm2，10 min）。咪喹莫特组：连续局部外涂咪喹莫特乳膏7 d为1次治疗，每次治疗间隔7 d，共治疗3次。以上3组每次均选择小鼠背部体积最大的3处瘤体进行治疗。对照组不予任何处理。

3.抗肿瘤效应评价：从治疗当天至治疗开始后第60天，每天观察小鼠的瘤体体积变化、肿瘤形态学变化及生存情况。瘤体体积观察：每3、4天以精密电子游标卡尺测量瘤体的最大长径和垂直短径，在Excel表中按公式V=ab2/2（V为体积，a为长径，b为短径）计算每只小鼠背部所有直径＞1 mm的瘤体体积之和，取每组均值绘制瘤体体积变化曲线。小鼠死亡时瘤体体积不再计算。第27天比较4组体积变化。肿瘤形态学观察：每3、4天以佳能G15相机采集小鼠大体照片，对比观察4组小鼠肿瘤形态学变化。生存情况：观察小鼠生命体征及一般情况，当小鼠瘤体直径＞15 mm、出现明显溃疡（直径＞10 mm）、恶病质或腹水时终止研究，对小鼠行安乐死。生命体征消失或病情加重符合安乐死标准均视为小鼠死亡，记录小鼠死亡情况与死亡时间，统计4组小鼠生存率，第60天比较4组生存率。

4.肿瘤组织病理学变化：另取12只成功建模的鳞癌小鼠，按照前述方法随机分成4组，每组3只，均于治疗后第5天，对小鼠行安乐死，取治疗部位瘤体组织用4%甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜下观察肿瘤组织病理学变化。

5.统计学分析：用SPSS13.0统计软件进行分析。采用t检验统计小鼠瘤体体积数据，采用Mantel⁃Cox logrank统计小鼠生存率数据，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.瘤体体积变化：记录小鼠瘤体体积，绘制小鼠瘤体体积变化曲线，见图1。治疗前，4组小鼠的瘤体体积差异无统计学意义。治疗后，对照组和咪喹莫特组小鼠瘤体体积逐渐增大，第27天2组瘤体体积显著大于治疗前（均P＜0.05），激光免疫组和激光组瘤体体积无明显增大（均P＞0.05）。其中，咪喹莫特组瘤体体积略小于对照组（P＞0.05）；激光组和激光免疫组瘤体体积明显小于对照组（均P＜0.05），而激光免疫组与激光组间差异无统计学意义（P＞0.05）。第60天对照组和咪喹莫特组小鼠已全部死亡；激光组小鼠瘤体体积逐渐增大，瘤体体积明显大于激光免疫组（P＜0.05）。

图1 4组小鼠瘤体体积变化曲线每个点代表均数

2.肿瘤形态学变化：用相机采集小鼠大体照片，观察4组小鼠肿瘤形态学变化，见图2。治疗前可见4组小鼠背部均散在数个直径1～4 mm瘤体。治疗开始后，对照组小鼠背部瘤体逐渐增多增大，第4周时可见瘤体明显增大增多，部分瘤体密集成片状分布，部分瘤体融合成较大的肿瘤，部分瘤体中央破溃坏死，形成溃疡或痂皮并伴有臭味。第6周小鼠已全部死亡。咪喹莫特组小鼠局部涂药部位出现少量鳞屑，背部瘤体仍逐渐增大增多，其余瘤体形态变化与对照组相似。激光组小鼠在照光后24 h照光部位瘤体表面轻度结痂，1周左右痂皮脱落，部分瘤体减小甚至消退，但18 d后开始复发，而未治疗瘤体继续增大增多，第4周可见瘤体明显增大增多，第6周瘤体更大更多。激光免疫组外涂咪喹莫特后局部皮肤出现鳞屑，激光照射后24 h照光部位瘤体表面发黑结痂，1、2周黑痂脱落。第4周可见明显黑痂，伴少量小瘤体，第6周可见单个0.5～32 mm3的瘤体经治疗后基本痊愈，部分残留瘢痕，观察至第60天未见复发；单个体积＞171.5 mm3的瘤体经治疗后仍残留肿瘤组织，未治疗瘤体生长亦缓慢，周围正常组织未见明显异常变化。

3.小鼠生存情况：对照组小鼠在实验开始后的第12天（1只）、第28天（2只）、第32天（1只）、第39天（1只）分别死亡。咪喹莫特组小鼠在实验开始后的第33、42、45、48、50天分别死亡1只。激光组小鼠在实验开始后的第52、53天分别死亡1只。激光免疫组小鼠在实验开始后60 d内无死亡。第60天时，与对照组比较，咪喹莫特组小鼠生存时间稍有延长（P＞0.05），激光组和激光免疫组小鼠生存时间明显延长（均P＜0.05），但激光组与激光免疫组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

4.组织病理学：对照组及咪喹莫特组细胞异形性明显，排列密集，无细胞死亡，可见角化珠。激光组及激光免疫组细胞大量死亡，瘤周可见多种炎症细胞，较对照组明显增多，尤以激光免疫组更明显。见图3。

图2 4组小鼠肿瘤形态学变化 治疗前4组小鼠背部均散在数个直径1～4 mm瘤体。治疗后，对照组小鼠背部瘤体逐渐增多增大，第4周瘤体明显增大增多，第6周小鼠已全部死亡。激光组小鼠部分治疗瘤体缩小甚至消退，但18 d后复发，而未治疗瘤体仍继续增大增多，第4周瘤体明显增大增多，第6周瘤体更大更多。咪喹莫特组小鼠背部瘤体逐渐增大增多，瘤体形态变化与对照组相似。激光免疫组第4周可见明显黑痂，伴少量小瘤体，第6周可见单个体积为0.5～32 mm3的瘤体经治疗后基本痊愈，部分残留瘢痕；单个体积＞171.5 mm3的瘤体经治疗后仍残留肿瘤组织，未治疗瘤体生长亦缓慢，周围正常组织未见明显异常变化

图3 4组小鼠瘤体在治疗后第5天组织病理学变化（HE×200） 对照组及咪喹莫特组细胞排列密集，无细胞死亡；激光组及激光免疫组细胞大量死亡，伴多种炎症细胞，尤以激光免疫组更明显

讨 论

研究认为，肿瘤最终能否被治愈、治疗后肿瘤是否会复发，很大程度上与宿主的免疫监视和免疫防御能力相关［7］。由于鳞癌的免疫原性弱，老年患者的免疫功能低下等无法诱导宿主产生有效的抗肿瘤免疫应答，是鳞癌复发、侵袭、转移的重要原因之一［8］。因此，寻找一种理想的抗肿瘤疗法，在杀伤鳞癌细胞的同时能有效激活宿主免疫，是非常重要的。激光免疫疗法主要是通过近红外激光局部照射肿瘤组织直接杀伤肿瘤细胞，同时联合免疫佐剂诱导宿主抗肿瘤免疫［9］。该疗法在治疗乳腺癌和皮肤黑素瘤方面取得了理想的疗效，不仅治疗部位肿瘤均有改善，未经直接治疗的转移瘤也有改善，该结果提示激光免疫疗法可有效诱导系统免疫效应，是一种有前途的肿瘤免疫治疗方法。

本研究以808 nm近红外激光为光源，咪喹莫特为免疫佐剂构建的激光免疫疗法治疗皮肤鳞癌小鼠。我们前期预实验结果和陈伟既往相关实验结果［10⁃11］显示，808 nm近红外激光照射10 min既能有效抑制肿瘤生长，又不产生明显的烫伤损害，因此本研究选用功能密度为1 W/cm2的808 nm近红外激光照射10 min。本文结果显示，单纯外涂咪喹莫特稍能延缓小鼠瘤体体积增长，提高小鼠生存率，与既往文献［12⁃13］相比，本文小鼠外涂咪喹莫特疗程较短，所以疗效略差。单纯激光照射治疗鳞癌小鼠时，照射部位瘤体体积缩小，部分甚至消退，与对照组相比，单纯激光治疗能延缓瘤体生长，提高小鼠生存时间，说明单纯激光治疗有一定的疗效。而将激光和咪喹莫特联合治疗即激光免疫治疗时，能明显提高小鼠的生存率，不仅能抑制治疗部位的瘤体，对未治疗部位的瘤体亦有明显抑制作用，疗效明显优于激光组。治疗期间周围正常组织无明显影响，小鼠亦无明显不良反应，可见激光免疫疗法是一种安全有效的抗皮肤鳞癌治疗方法，尤其是对多发性或伴有转移的皮肤鳞癌具有较大的潜在应用价值。然而，本研究也发现，激光免疫疗法虽然对0.5～32 mm3的小体积鳞癌疗效显著，但是不能彻底清除＞171.5 mm3的鳞癌，可能不适用于大体积皮肤鳞癌治疗。本文组织病理显示单纯激光照射能直接促使肿瘤细胞大量死亡，联合咪喹莫特能进一步促使肿瘤细胞死亡，增加肿瘤周围炎症细胞浸润，从组织病理层面进一步证明了激光免疫疗法的有效性及免疫效应。

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Antineoplastic effect of laser immunotherapy in mice with multiple cutaneous squamous cell carcinoma

Luo Min,Shi Lei,Zhang Fuhe,Chen Wei,Wang Xiuli
Shanghai Skin Disease Clinical College of Anhui Medical University,Shanghai 200443,China（Luo M,Zhang FH,Wang XL）;Shanghai Dermatology Hospital,Institute of Photomedicine,Tongji University School of Medicine,Shanghai 200443,China（Luo M,Shi L,Zhang FH,Chen W,Wang XL）;Biophotonics Research Laboratory,University of Central Oklahoma,Edmond 73034,USA（Chen W）

ObjectiveTo evaluate the antineoplastic effect of laser immunotherapy in mice with multiple cutaneous squamous cell carcinoma（CSCC）.MethodsNormal immunocompetent hairless SKH ⁃1 mice were consecutively irradiated by ultraviolet rays to establish mouse models of multiple CSCC.Then,20 CSCC⁃bearing mice were randomly and equally divided into 4 groups:laser group irradiated with an 808⁃nm near⁃infrared laser（1 W/cm2,10 minutes）once every two weeks for a total of 3 sessions,laser immunotherapy group irradiated with an 808⁃nm near⁃infrared laser as above and topically treated with imiquimod cream once a day for 3 days before and after each session of irradiation,imiquimod group treated with imiquimod cream as in the laser immunotherapy group,and control group receiving no treatment.The volume of tumors was calculated,and their morphology as well as the survival of mice were observed after the treatment.Thettest and Mantel⁃Cox log⁃rank test were used to compare the volume of tumors on the dorsum and survival rates of mice,respectively,on days 27 and 60 after the start of treatment.Another 12 CSCC⁃bearing mice were randomly and equally divided into the 4 groups mentioned above,and tumor tissues were resected from these mice for histopathological examination on day 5 after the first treatment.ResultsOn day 27,the volume of tumors significantly increased in the control group and imiquimod group（bothP＜ 0.05）,but experienced no significant increase in either of the other two groups compared with that before the start of treatment（bothP＞0.05）.Moreover,the volume of tumors in the control group was slightly larger than that in the imiquimod group（P＞0.05）,but significantly larger than that in the laser group and laser immunotherapy group（bothP＜ 0.05）.The volume of tumors in the laser group increased,and was significantly larger than that in the laser immunotherapy group on day 60（P＜ 0.05）.Mice all died within 40 days in the control group,and within 50 days in the imiquimod group;one mouse died on days 52 and 53 separately,and the other mice all survived longer than 60 days in the laser group;no mice died within 60 days in the laser immunotherapy group.By day 60,the survival time of mice was slightly longer in the imiquimod group（P＞0.05）,significantly longer in the laser group and laser immunotherapy group compared with the control group（bothP＜ 0.05）,but similar between the laser group and laser immunotherapy group（P＞0.05）.Histopathological examination showed that 5⁃day topical application of imiquimod cream did not cause death of tumor cells,but numerous tumor cells died in the laser group and laser immunotherapy group.Multiple inflammatory cells were observed around the tumors,and the number of the inflammatory cells was obviously larger in both the laser group and laser immunotherapy group,especially in the latter group,compared with the control group.ConclusionLaser immunotherapy is a new effective and safe treatment for CSCC in mice,and has potential value especially in the treatment of multiple or metastatic CSCC.

Neoplasms,squamous cell;Laser;Immunity;Mice

Wang Xiuli,Email:xlwang2001@aliyun.com

2016⁃04⁃07）

（本文编辑：吴晓初）

王秀丽，Email：xlwang2001@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.09.004

国家自然科学基金（81472796、81272990）；上海市青年科技英才扬帆计划项目（15YF1410700）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81472796，81272990）;Yang Fan Program of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality（15YF1410700）