低密度脂蛋白受体基因rs688位点多态性与缺血性脑血管病的相关性研究*

李娜，郑伟，胡晓芳

（1.锦州医科大学研究生院，辽宁 锦州 121001；2.沈阳军区总医院检验科，辽宁 沈阳 110016）

低密度脂蛋白受体基因rs688位点多态性与缺血性脑血管病的相关性研究*

李娜1，郑伟2，胡晓芳2

（1.锦州医科大学研究生院，辽宁 锦州 121001；2.沈阳军区总医院检验科，辽宁 沈阳 110016）

目的探讨低密度脂蛋白受体（LDLR）rs688基因多态性与缺血性脑血管病(ICVD)发生的相关性。方法分别检测264例ICVD患者及180例对照组LDLR的rs688基因多态性、血清LDL、总胆固醇（TC）和Toll样受体2（TLR 2）水平。结果LDLRrs688基因型分布和T等位基因频率，差异有统计学意义（P<0.05）。TT型和总胆固醇型血清LDL、TC水平高于CC基因型，差异有统计学意义（P<0.05），但TT型和总胆固醇型比较，差异无统计学意义（P>0.05）。ICVD组患者的血清LDL、TC、TLR 2水平高于对照组，差异有统计学意义（P< 0.01）。相关分析结果显示，ICVD组患者血清TLR 2与血清LDL水平呈正相关（r=0.801，P<0.05）。结论高浓度LDL、总胆固醇血症是导致ICVD发生的独立危险因素。而LDLRrs688的T等位基因是ICVD发病的易感基因，该基因突变可能通过上调血清LDL、TC、TLR 2水平进而介导ICVD的发生。TLR 2与血清LDL之间存在的正反馈调节机制的过度活化，可能是介导ICVD发生的重要因素。

缺血性脑血管病；低密度脂蛋白受体；基因多态性

急性脑血管病是神经系统常见病，多发病，病情危急，易复发，其高致残率、高死亡率成为影响中老年人生命质量最严重的疾病之一[1-4]。其中，缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）占脑血管病的80%[5]。因此，更深入阐明ICVD的发病机制是目前亟待解决的重点课题。

有研究显示，血脂代谢异常是导致ICVD发生的主要致病因子[6]，而低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor，LDLR）作为介导血脂代谢的关键效应分子[7]，其基因多态性是否通过影响血脂代谢水平，进而参与ICVD的发生，目前尚未充分阐明。本研究聚焦于ICVD患者LDLRrs688基因多态性的变化特点，比较不同基因型患者低密度脂蛋白（low-densitylipoprotein，LDL）、总胆固醇（total cholesterol，TC）和Toll样受体2（Toll like receptor-2，TLR2）水平的差异，旨在探讨ICVD发生的相关性及其可能机制，进而为ICVD的诊断提供有益的新的线索。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2013年1月-2013年12月沈阳军区总医院神经内科住院的ICVD患者264例为ICVD组。其中，男性122例，女性142例；平均（61.22±11.14）岁。入组标准：首次发病，未进行降脂、抗凝治疗。患者均有颅脑CT和/或MRI影像证据，诊断符合1995年全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准[3]。排除有肝肾疾病、糖尿病、恶性肿瘤、甲状腺功能异常、妊娠、服用抗惊厥药物者。无酗酒史，未服用免疫抑制剂、多种维生素及叶酸。对照组为本院同期无脑血管疾病的汉族健康体检者180例。其中，男性90例，女性90例；平均（60.85±10.33）岁。两组在年龄、性别方面差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2方法

1.2.1主要仪器与试剂实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）仪（美国ABI公司），紫外分光光度计（日本岛津公司），电泳槽及电泳仪（美国EC公司），凝胶成像系统（日本Kodak公司），日立008全自动生化分析仪（日本日立公司）。全血DNA提取试剂盒、PCR反应试剂、DNA Marker、Loading buffer均为宝生物工程大连有限公司产品，琼脂糖（美国Promega公司），溴化乙锭（美国Amresco公司），LDL、TC、TLR2检测试剂盒（购自武汉优尔生化学生物工程有限公司）。

1.2.2标本采集与指标检测ICVD组（于确诊入院的第1天清晨）及对照组在空腹状态下采集前臂无抗凝静脉血和乙二胺四乙酸二钾抗凝静脉血各3ml。无抗凝静脉血1 h内离心（3 000 r/min，10 min）分离血清后，置于-70℃冰箱冷冻保存待测。乙二胺四乙酸二钾抗凝静脉血置于-70℃冰箱冷冻保存，待提取DNA。全自动生化分析仪检测血清LDL、TC浓度，酶联免疫吸附法测定血清中TLR2含量，所有操作严格按说明书进行。

1.2.3全血基因组DNA提取全血DNA提取试剂盒提取人全血DNA，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。测定各样品OD260和OD280吸光度值，根据OD260/OD280值分析DNA样品的纯度。

1.2.4PCR引物设计与合成PCR引物序列参考文献[1]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（PAGE级纯化，纯度≥99%）。PCR产物片段长度为200bp。正向引物：5'-CGCCTCTACTGGGTTGAC T-3'，反向引物：5'-CATCTTGGCTTGAGTGATCT-3'。1.2.5实时PCR扩增LDLRrs688基因片段使用PCR反应试剂（Prime STAR HS DNA聚合酶，dNTP Mixture，Mg+），反应体系为：DNA模板5μl，Primer1、Primer 2各2μl（浓度为20μmol），Prime STAR HS DNA聚合酶0.5μl，5×buffer 10μl，dNTP 4μl加灭菌蒸馏水28.5μl，使最终总体系为50μl。

1.2.6PCR循环程序设置使用ABI-7500 PCR仪，98℃变性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检查后，于4℃保存扩增产物，送至上海生工生物工程技术服务有限公司完成基因测序，得出基因型。根据测序结果分为TT、TC和CC 3组。

1.2.7PCR产物检测取5μl PCR产物，制备3%的琼脂糖凝胶电泳（40ml Tris硼酸，1.2g琼脂糖，内含0.5μg/ml溴化乙锭），倒入模具中待其自然凝固后，在电泳槽中倒入0.5×Tris硼酸电泳缓冲液。将PCR产物与Loading buffer混匀后上样，同时一侧加样孔加入2000bp DNA Marker作为对照。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，基因型采用频率计数法，用Hardy-Weinberg平衡定律计算等位基因频率。组间基因型及等位基因频率比较用χ2检验。组间比较用t检验、方差分析。相关性分析用Spearman相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组的血脂水平比较

ICVD组血清LDL（3.6±1.3）mmol/L、TC（5.6± 1.6）mmol/L，均高于对照组，差异有统计学意义。见表1。

表1　两组血脂水平比较（mmol/L±s）

表1　两组血脂水平比较（mmol/L±s）

注：†与对照组比较，P<0.05

组别LDLTC ICVD组（n=264）3.6±1.3†5.6±1.6†对照组（n=180）2.4±0.84.6±1.0 t值4.843.37 P值0.0000.001

2.2LDLR rs688多态性结果

PCR产物电泳结果显示，目的基因产物的片段长度为200 bp（见图1）。对PCR产物进行基因测序，分别得到LDLRrs688基因的TT型、TC型和CC型（见图1中2～4箭头所指位点位置）。

图1　PCR产物电泳图

2.3两组的LDLR rs688基因型分布比较

ICVD组和对照组的LDLRrs688基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，各等位基因均达到遗传平衡，具有群体代表性。ICVD组与对照组间LDLRrs688的3种基因型（TT、TC、CC）频率分别为3.8%、24.2%、72.0%，2.2%、8.9%、88.9%，两组基因型分布差异有统计学意义。ICVD组T等位基因频率为15.9%，高于对照组6.7%。各组基因型分布及等位基因频率结果见表2。

表2　两组LDLRrs688基因型及等位基因分布比较

2.4LDLRrs688基因多态性与血清LDL、TC、TLR2水平的关系

ICVD组3种基因型血清LDL、TC水平均高于对照组（FLDL=14.12，FTC=6.74，P=0.001）。ICVD组及对照组TT型和TC型LDL水平分别高于CC基因型（F=3.11，P=0.034），但TT型和TC型血清LDL水平比较差异无统计学意义（F=2.13，P=0.065），ICVD组及对照组的3种基因型TC水平与LDL水平一致。ICVD组3种基因型血清TLR2水平均高于对照组（F=11.43，P=0.005）。ICVD组及对照组TT型和TC型TLR2水平分别高于CC基因型（F=4.43，P= 0.021），但TT型和TC型血清TLR2水平比较差异无统计学意义（F=2.44，P=0.065）。见图2～4。

图2　各组基因型的血清LDL水平比较（±s）

2.5两组的血清TLR2水平比较

ICVD组血清TLR2水平（5.0±2.6）ng/ml高于对照组（3.33±1.67）ng/ml，差异有统计学意义（t=3.488，P<0.01）。相关性分析结果显示ICVD组血清TLR2与血清LDL水平呈正相关（r=0.801）。见图5、6。

图3　各组基因型的血清TC水平比较（±s）

图4　各组基因型的血清TLR2水平比较（±s）

图5　两组血清TLR2水平比较（±s）

图6　ICVD组血清TLR2与血清LDL水平相关性

3 讨论

脑梗死是中老年人的常见病及多见病，随着人口老龄化，脑梗死的发病率呈上升趋势[7]，动脉粥样硬化是ICVD病发生的重要病理基础[8]，而血脂异常会引起心脏及大血管动脉粥样硬化[7]。高浓度LDL血症和高胆固醇血症与动脉粥样硬化密切相关，大脑内部或外部的血脂异常或代谢紊乱可能是ICVD发生的始动因素[9]。有研究显示，脑梗死的发生与动脉粥样硬化的程度成正相关[7]。本研究结果显示，ICVD患者的血清LDL和TC水平明显高于对照组。由此提示，血清LDL和TC水平与ICVD的发病密切相关。其机制可能为：①脑动脉血管壁上LDL的大量积聚，增加巨噬细胞对LDL的摄取，促进泡沫细胞的形成，增加脑动脉粥样硬化发生的风险[10]。②高浓度的LDL激发体内的氧化应激发应，经氧化修饰后，通过细胞毒性作用、化学趋化作用，影响血管平滑肌增殖，加速泡沫细胞形成，影响纤溶和凝血等机制促进脑动脉粥样硬化的形成和发展[11-12]，从而介导ICVD的发生。③正常情况下，LDL被细胞摄取后，经胞内溶酶体降解成TC，为组织所利用。当细胞内的TC达到一定量后，细胞启动TC逆转运机制，将多余的TC随血液循环至肝脏，实现代谢平衡[13]。但当LDL水平过高或代谢障碍时，TC的代谢平衡也被打破，细胞内TC增多，会造成细胞内的脂质沉淀、泡沫细胞形成，循环中TC增多，会导致高胆固醇血症、TC淤积和血管壁黏附，促进脑动脉粥样硬化的形成和ICVD的发生[14]。

LDLR是介导LDL功能的关键效应分子，主要功能是结合LDL将其携带的脂类内吞入细胞降解，维持血浆胆固醇水平恒定[15]。由此提示，LDLR可能参与ICVD的发生。

rs688基因位于LDLR基因外显子12上，与LDLR外显子12剪接效率降低有关[16]。有研究显示，rs688T等位基因与动脉粥样硬化性疾病密切相关[17]。本研究采用PCR扩增结合基因测序技术检测LDLRrs688基因多态性，结果显示，ICVD组与对照组LDLRrs688 3种基因型频率比较差异有统计学意义。等位基因频率分析显示，ICVD组LDLRrs688的T等位基因频率高于对照组，由此进一步证实，LDLRrs688的T等位基因是ICVD发病的易感基因。与此同时，本研究结果还显示LDLRrs688的TT型和TC型LDL、TC水平分别高于CC基因型，而TT型和TC型比较，差异无统计学意义。由此提示，LDLRrs688的T等位基因突变是引起血清LDL、TC水平升高的关键因素。LDLRrs688TT型和TC型基因型可能与ICVD的发病密切相关。

另有研究显示，LDL影响血清TLR2的激活和表达，血清中LDL浓度增高或者被修饰引起内皮细胞损伤，内皮细胞损伤后产生的内源性配体激活可造成TLR2活性高表达[18]。活化的TLR2可使动脉内膜增厚，促进泡沫细胞形成，增加动脉粥样硬化病变面积[19]。本研究结果显示，ICVD组的血清TLR2水平明显高于对照组，且与血清LDL水平呈正相关。由此可提示，TLR2与LDL可能存在正反馈的调节机制，而ICVD的发生可能正是由于这种调节机制过度活化的结果。本研究结果进一步显示，LDLR rs688的TT型和TC型TLR2水平高于CC基因型，而TT型和TC型比较，差异无统计学意义。由此可以推测，ICVD患者高水平的TLR2的发生可能与LDLRrs688基因突变有关，但具体机制尚需进一步阐明。

高LDL、TC血症是导致ICVD发生的独立危险因素。而LDLRrs688的T等位基因是ICVD发病的易感基因，此基因突变可能通过上调血清LDL、TC、TLR2水平进而介导ICVD的发生。值得关注的是，TLR2与LDL之间存在的正反馈调节机制的过度活化，可能是介导ICVD发生的重要因素。

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（申海菊编辑）

Correlation ofLDLRgene rs688 polymorphisms with ischemic cerebrovascular disease*

Na Li1，Wei Zheng2，Xiao-fang Hu2
（1.Graduate School，Jinzhou Medical University，Jinzhou，Liaoning，121001，China；2.Clinical Laboratory，General Hospital of Shenyang Military Command，Shenyang，Liaoning 110016，China）

Objective To investigate the relationship between low-density lipoprotein receptor（LDLR）gene rs688 polymorphism with ischemic cerebrovascular disease（ICVD）.Methods TheLDLRgene rs688 polymorphism for 264 ICVD patients（ICVD group）and 180 healthy people（control group）were detected by PCR and direct nucleotide sequencing analysis.Meanwhile，the serum levels of LDL，TC，and Toll-like receptor 2（TLR2）were detected in all the groups.Results The genotype distribution ofLDLRrs688 and the frequency of T allele had significant differences between the ICVD and the control groups（P＜0.05）.Serum LDL and TC levels in the patients with CC genotype were obviously lower than those in the patients with TT and TC genotypes（P＜0.05）.But serum LDL and TC levels had no significant differences between the patients with TT and TC genotypes（P＞0.05）.Serum LDL，TC and TLR2 levels in the ICVD group were significantly higher than those in the control group（P＜0.01）.Meanwhile，correlation analysis showed that serum TLR2 level was positively correlated with LDL level in the ICVD group（r=0.801，P＜0.05）.Conclusions High levels of serum LDL and TC are independent risk factors for ICVD.T allele ofLDLRrs688 is a susceptible gene ofICVD.The polymorphism ofLDLRgene rs688 is a genetic risk factor of elevating the serum levels of LDL and TC.High level of serum TLR2 is closely associated with occurrence of ICVD.

low-density lipoprotein receptor；ischemic cerebrovascular disease；gene polymorphism

R 743.34

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.007

1005-8982（2016）19-0032-05

2015-11-09

辽宁省自然科学基金（No：201102240）

胡晓芳，E-mail：hxf630212@msn.com.cn