肠内代谢物腹腔注射对大鼠神经内分泌和行为学的影响*

白志余，周东蕊，张仁敏，李娜，白志茂，张红琳，张丽玲，庞桂芬

（1.承德医学院附属医院呼吸内科，河北 承德 067000；2.东南大学学习科学研究中心，江苏 南京 210000；3.东南大学公共卫生学院，江苏 南京 210000；4.南京晓庄学院，江苏 南京 210017）

肠内代谢物腹腔注射对大鼠神经内分泌和行为学的影响*

白志余1，周东蕊2，张仁敏2，李娜2，白志茂3，张红琳4，张丽玲4，庞桂芬1

（1.承德医学院附属医院呼吸内科，河北 承德 067000；2.东南大学学习科学研究中心，江苏 南京 210000；3.东南大学公共卫生学院，江苏 南京 210000；4.南京晓庄学院，江苏 南京 210017）

目的观察肠内代谢物对大鼠行为学的影响，并初步探讨其可能机制。方法采集健康儿童新鲜粪便，用低温高速离心法提取肠内代谢物。将26只SD大鼠随机分为两组（对照组10只，实验组16只），实验组大鼠于腹腔注射肠内代谢产物（0.5ml/只），对照组大鼠用生理盐水处理。采用高架十字迷宫实验观察两组大鼠行为学差异，并测定其脑组织海马区、下丘脑、纹状体内5-羟色胺（5-HT）及多巴胺（DA）表达水平。结果实验组与对照组SD大鼠行为学比较，发现进臂总次数[实验组（38.00±7.51）次、对照组（14.75±8.62）次]和开臂时间比例[实验组（36.24±12.30）%、对照组（21.37±8.32）%]比较，差异有统计学意义（P<0.05）。海马和下丘脑内5-HT含量、海马和纹状体内DA含量比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论健康儿童肠内代谢物使大鼠行为学明显改变，并对脑内神经递质有一定影响。

肠内代谢物；腹腔注射；大鼠行为学；5-羟色胺；多巴胺

肠内代谢产物是消化系统内消化酶与肠道菌群共同代谢的产物，既有对机体有益的营养物质、生物因子，也有一些有毒物质[1-2]。当饮食相同的情况下，除遗传基因个体差异外，代谢产物的差异主要取决于机体肠道微生物群落结构的差异。肠道微生物是存在于宿主消化道内的微生物群落，数量极其庞大，人体肠道微生物细菌数量是人体细胞的10倍[3]，其编码基因约为人体编码基因的100倍[4]。这么庞大一个微生物群体起着营养物质降解与消化吸收，合成人体需要的某些免疫因子、神经递质及前体物质等重要作用。肠道微生物及其代谢产物对机体免疫和神经信号传导等起重要的调节作用[5-6]。多项研究表明，肠道和大脑之间通过肠道微生物的分泌与代谢作用，以及肠道微生物对肠神经和免疫系统的刺激作用，来完成重要的双向调节功能，称为菌群脑肠轴[7]，如肠道微生物及其代谢产物直接参与某些神经与免疫的关键信号通路传导[8]，参与大脑与神经的发育，以及调节人体的行为表现等[9]。健康状态下肠道微生物组成一个复杂而稳定的微生态环境，起重要的肠黏膜屏障作用。当机体受创，免疫功能缺损或胃肠功能紊乱，肠黏膜屏障受损的情况下，本不能通过肠黏膜屏障的代谢物就会突破肠黏膜屏障，使机体出现病变。多项研究发现，功能性胃肠疾病患者多数存在焦虑、抑郁等情绪行为异常[10-11]。自闭症作为一项广泛性神经发育异常疾病，近年来发病率逐年增高。自闭症儿童多数具有胃肠道问题，如反复的胃肠炎症及肠漏[12]。肠黏膜的通透性增加，肠内代谢物及一些有毒分子进入血液循环，某些分子甚至能够通过血脑屏障作用于大脑，引起行为学及脑神经递质的变化[13]。本实验通过对大鼠腹腔注射肠内代谢物，避开肠黏膜屏障，建立肠漏模型，进一步了解肠内代谢产物对大鼠行为及脑神经递质分泌，如5-羟色胺（Serotonin，5-HT）、多巴胺（Dopamine，DA）的影响。为自闭症等神经发育障碍性疾病的发病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

无特定病原体级SD大鼠，26只，10 d大小，南京青龙山动物饲养厂提供。标准品5-HT、5-羟吲哚乙酸、3，4-二羟基苯甲胺氢溴酸盐，购自美国Sigma aldrich公司，乙腈（色谱纯）购自山东禹王实业公司化学试剂厂，乙二胺四乙酸、庚烷磺酸钠购自上海化学试剂研究所，石蜡膜购自美国Alcan Packaging公司。

1.2仪器与设备

低温高速离心机Eppendorf 5804R购自德国Eppendorf公司，旋涡振荡器Vortex-2 Genie购自美国Scientific Industries公司，大鼠高架十字迷宫（elevated plus maze，EPM）购自上海精宏实验设备有限公司，LC-20AD高效液相色谱仪、L-ECD-6A电化学检测器、LC-20AD双泵购自日本岛津公司。

1.3实验方法

1.3.1肠内代谢物的提取将采集的健康儿童新鲜粪便用一定体积的无菌0.9%生理盐水溶解1.0∶0.5（重量g∶体积ml），混匀，低温4℃、500r/min离心5min。取上清液，低温4℃、5000r/min离心10min。取上清液，低温4℃、8000r/min离心15min。取上清液，低温4℃、12000r/min离心30min，收集上清液。过滤（0.22μm孔径），重复2次，将液体4℃保存。整个手动操作过程要在低温冰上进行，离心过程管口用蜡膜封口，避免挥发性成分挥发。

1.3.2大鼠腹腔注射将26只SD大鼠饲养1周适应环境后，随机分为两组（对照组10只，实验组16只），以肠内代谢物和0.9%生理盐水按0.5 ml分别注射实验组和对照组，隔天注射1次，连续注射20d后停止注射，然后饲养半个月。动物房室温25～30℃。

1.3.3大鼠行为学测试实验室内光线昏暗并保持恒亮，室温25℃左右，保持安静。迷宫测试前将每只大鼠单独放入塑料盒中，任其自由探究5 min后迅速置于EPM的中央平台处，使其头部正对其中一个开放臂，释放后即开始记录下述指标：进入开放臂次数（open arm entry，OE）、进入开放臂时间（open arm time，OT）、进入封闭臂次数（close alm entry，CE）、进入封闭臂时间（close arm time，CT）。由以上指标分别计算出：①进入开放臂和封闭臂的总次数（OE+CE）；

1.3.4大鼠脑组织神经递质检测①大鼠EPM行为学测试结束后，立即断头处死，迅速在冰盘上剪开颅盖和脑膜，然后分离脑组织，包括海马、下丘脑、纹状体，迅速置于液氮中冷冻保存；②取各部分组织置于玻璃匀浆器中，加入少量高氯酸（15%），上下匀浆5 min，将匀浆液转移至1.5 ml离心管中，用15%高氯酸荡洗匀浆器，洗液并入离心管，用15%高氯酸定容至1ml。脑组织匀浆12000r/min高速离心6min，取上清液，置入-70℃冰箱冷冻保存待测；③样品测定时取上清液500μl于离心管中，加入10μg/ml内标3，4-二羟基苯甲胺氢溴酸盐溶液，涡旋，20μl直接进样，内标法计算样品中神经递质5-HT和DA的含量。流动相：30mmol/L柠檬酸，45mmol/L磷酸二氢钠，2mmol/L庚烷磺酸钠，0.3mmol/L乙二胺四乙酸，6%（v/v）乙腈，NaOH调pH 4.00；流速为1.0 ml/min，柱温为30℃，进样量20μl。

1.4统计学方法

采用SPSS 18统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，实验组与对照组均数间的比较，在方差齐时选用成组t检验，方差不齐时选用校正t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠行为学测试结果

随机挑选4只对照组大鼠和6只实验组大鼠进行行为学测试。从EPM视频采集大鼠运动轨迹分析图中可知实验组和对照组大鼠运动轨迹明显不同。实验组大鼠进臂总次数为（38.00±7.51）次，对照组大鼠进臂总次数为（14.75±8.62）次，差异有统计学意义（P<0.05），实验组大鼠进臂总次数高于对照组大鼠进臂总次数。实验组大鼠进入开臂时间比例为（36.24±12.30）%，对照组大鼠进入开臂时间比例为（21.37±8.32）%，差异有统计学意义（P<0.05），实验组大鼠进入开臂时间比例比对照组大鼠高。见表1和附图。

表1　两组大鼠高架迷宫行为学测试结果（±s）

表1　两组大鼠高架迷宫行为学测试结果（±s）

组别进臂总次数进臂总时间/s开臂次数比例/%开臂时间比例/%对照组（n=4）实验组（n=6）14.75±8.62 38.00±7.51 779.92±81.38 780.17±61.34 40.08±9.53 48.55±9.37 21.37±8.32 36.24±12.30 t值4.5340.0061.3912.381 P值0.0020.9960.2020.044

2.2SD大鼠脑神经递质表达水平

两组大鼠脑组织内神经递质表达水平明显不同，实验组和对照组大鼠海马内5-HT含量分别为（54.21±19.68）和（147.59±74.63）ng/g，差异有统计学意义（P<0.05），实验组大鼠海马内5-HT含量低于对照组。实验组和对照组大鼠下丘脑内5-HT含量分别为（116.09±57.70）和（577.34±340.97）ng/g，差异有统计学意义（P<0.05），实验组大鼠下丘脑内5-HT含量低于对照组。实验组和对照组大鼠海马内DA含量分别为（18.78±14.08）和（68.34±30.09）ng/g，差异有统计学意义（P<0.05），实验组大鼠海马内DA含量低于对照组。实验组和对照组大鼠纹状体内DA含量分别为（274.11±180.78）和（736.37±204.68）ng/g，差异有统计学意义（P<0.05），实验组大鼠纹状体内DA含量低于对照组，表明肠内代谢物对脑部神经递质有显著影响。见表2、3。

附图　SD大鼠行为学测试结果（轨迹图）

表2　两组大鼠脑组织内5-HT含量比较（ng/g±s）

表2　两组大鼠脑组织内5-HT含量比较（ng/g±s）

组别海马下丘脑纹状体对照组（n=4）147.59±74.63577.34±340.97349.15±257.41实验组（n=6）54.21±19.68116.09±57.7059.99±21.93 t值2.4462.6802.241 P值0.0400.0280.055

表3　两组大鼠脑组织内DA含量比较（ng/g±s）

表3　两组大鼠脑组织内DA含量比较（ng/g±s）

组别海马下丘脑纹状体对照组（n=4）68.34±30.0988.01±70.52736.37±204.68实验组（n=6）18.78±14.0837.95±28.31274.11±180.78 t值3.0771.3493.767 P值0.0150.2140.005

3 讨论

本研究以肠内代谢产物对SD大鼠进行腹腔注射，避开肠黏膜屏障，模拟肠黏膜通透性较大时，肠内代谢物易位进入机体内，从而对大鼠行为及神经递质表达的影响。通过EPM实验发现，肠内代谢产物可以导致SD大鼠行为学明显改变，并使脑组织内神经递质（5-HT、DA）的表达出现显著变化。

EPM模型为抗焦虑研究中公认的非条件反射模型。以进入开放臂的百分数和在开放臂停留时间的百分数为实验指标，来反映动物的焦虑状态。如果一个因素增加动物对开臂的偏爱（即增加进入开臂的次数和在开臂内滞留时间），却不改变入臂总次数和入臂总时间，即开臂进入次数百分比和开臂滞留时间百分比升高，则认为该因素具有抗焦虑的作用。实验组与对照组开臂时间比例比较，差异有统计学意义，说明实验组未出现对照组应有的焦虑状态。人类和啮齿类动物的焦虑情绪及焦虑样行为基本机制可能不同。啮齿类动物的焦虑样行为是反应探索和逃避危险之间的平衡。本研究的实验组比对照组焦虑行为减弱的现象，不能单纯的看做抗焦虑作用，可能实验组大鼠没有正常大鼠的恐惧感或不能如正常大鼠那样识别危险，而孤独症儿童有时也不能识别危险[14]。因此笔者推测肠内代谢物毒素可能导致大鼠孤独症症状类似的情绪、行为异常状态。

5-HT是单胺类中枢神经递质，通过受体介导调节情绪、睡眠、食欲、痛觉等。DA也是单胺类中枢性神经递质，通过多巴胺转运体作用于多巴胺受体，在认知、情感等中枢神经系统功能过程中发挥作用。孤独症等精神障碍疾病患者存在脑神经递质的变化。比如孤独症儿童存在单胺类神经递质异常，部分孤独症儿童脑内多巴胺能神经系统存在异常，也有报道称，孤独症儿童脑内5-HT表达出现异常[15-16]。但孤独症亚型非常多，病因及患病机制都非常复杂，临床症状也不尽相同，至今仍存在争论，没有统一的共识。虽有报道称，约30%的孤独症儿童脑中5-HT较正常儿童高[17]，部分患儿脑内多巴胺转运体增高，可见不是全部孤独症儿童都会5-HT过度表达，也不是全部孤独症儿童都会多巴胺转运体增高。而可以肯定的是，该类患者脑神经递质都会出现或多或少的异常表达。本研究实验组与对照组比较大鼠海马中的5-HT、海马、纹状体内的DA含量，差异有统计学意义，说明肠内代谢物确实可以导致单胺类神经递质出现异常表达。

肠道微生物及其代谢产物可以影响肠道黏膜免疫系统，影响肠黏膜屏障功能。正常情况下，肠黏膜有选择性通透，允许营养物质及部分生物因子通过，阻碍有毒物质的通过。大量研究证明，孤独症、焦虑、抑郁等疾病会引起肠道菌群失衡，进而影响肠道黏膜免疫，出现慢性炎症表现，破坏肠黏膜屏障功能，使肠道通透性增加，允许细菌产物，细胞因子和趋化因子，进入流通和跨血脑屏障，影响大脑和行为[18]。近几年，研究越来越多地考虑到肠道菌群与脑功能及心理构成之间的相互关系[19]。对于肠道菌群及其代谢物通过菌群脑肠轴来调节大脑的发育及行为表现的研究也越来越深刻。研究发现，可以通过影响小鼠肠道菌群代谢产物来改变其行为[20]；增加益生菌可修复肠黏膜屏障，恢复其通透性[21]；孤独症儿童口服万古霉素治疗可明显改善其行为、认知及胃肠道症状[22]。上述研究都进一步佐证肠道菌群紊乱、肠黏膜屏障受损导致其通透性增大后，肠道微生物及其代谢产物会引起或加重行为学及脑神经递质的异常变化，即佐证本实验的科学性、合理性。

在进一步的研究中，笔者将会将不同疾病类型的代谢物通过腹腔注射和大鼠行为学实验，来验证不同代谢物对大鼠行为学与神经内分泌的影响，并找出影响大鼠反应的有效物，为各类精神疾病研究与治疗提供更为有价值的理论依据，并且笔者会进一步完善实验方法，比如增加5-HT和DA组织切片，为实验结论提供更为有说服力的实验依据。

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（童颖丹编辑）

Effects of intraperitoneal injection of intestinal metabolite on neurotransmitters and behavior in rats*

Zhi-yu Bai1,Dong-rui Zhou2,Ren-min Zhang2,Na Li2,Zhi-mao Bai3, Hong-lin Zhang4,Li-ling Zhang4,Gui-fen Pang1
（1.Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde，Hebei 067000，China；2.Research Center for Learning Science，Southeast University，Nanjing，Jiangsu 210000，China；3.School of Public Health，Southeast University，Nanjing，Jiangsu 210000，China；4.Nanjing Xiaozhuang University，Nanjing，Jiangsu 210017，China）

Objective To observe the effects of intestinal metabolites on behavior of rats，and explore its possible mechanism.Methods Fresh feces of healthy children was collected.The intestinal metabolites were extracted with high-speed centrifugation at low temperature.Twenty-six SD rats were randomly divided into 2 groups（10 in control group，16 in experimental group）.The rats of the experimental group in the hippocampus and striate body had significant differences between the experimental group and the control group（P＜0.05）.Conclusions Intestinal metabolites of healthy children can change the behavior of rats，and have certain influence on neurotransmitters in the brain.

intraperitoneal injection of intestinal metabolites（0.5 ml/rat），and the control group rats were treated with normal saline instead.The overhead cross maze experiment was used to observe the differences in behavior between the two groups.And 5-hydroxytryptamine（5-HT）and dopamine（DA）expression levels were determined in the hypothalamus，hippocampus and striate body of the rats.Results There were significant differences in the total number of reaching-in arm［（38.00±7.51）vs（14.75±8.62）］and open arm residence time［（36.24±12.30）vs（21.37±8.32）］bwteen the experimental group and the control group（P＜0.05）.The content of 5-HT and DA

intestinal metabolite；intraperitoneal injection；behavior；serotonin；dopamine

R 749；R 363

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.004

1005-8982（2016）19-0017-06

2016-03-29

江苏省苏州市科技支撑计划（No：SS201337、SNG201449）

庞桂芬，E-mail：pang-gf@sohu.com