麻风患者血清Th1/Th2/Th17相关细胞因子检测

李建可　王　川　李富荣　初同胜　刘殿昌　于修路　刘　红　张福仁



·论著·

麻风患者血清Th1/Th2/Th17相关细胞因子检测

李建可1,2王川2李富荣2初同胜2刘殿昌2于修路2刘红2张福仁2

目的：检测麻风患者血清中Th1/Th2/Th17相关细胞因子水平，探讨其在麻风发病中的作用。方法：利用微量样本多重蛋白定量技术检测12例新发麻风患者，29例治愈麻风患者及37例正常人血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ和IL-17A水平。利用Kruskal-Wallis和Nemenyi方法进行组间比较。结果：新发组患者血清IL-1和IL-2水平显著高于治愈组(P<0.005)；新发组及治愈组患者血清IL-6水平均显著高于对照组(P<0.005)；新发组患者血清IFN-γ 和IL-17A水平显著高于对照组(P<0.005)。新发组、治愈组和对照组IL-4、IL-10和TNF浓度差异无统计学意义。结论：Th1/Th2/Th17某些相关细胞因子可能与麻风的发病有关。

麻风；细胞因子；微量样本多重蛋白定量技术

麻风是由麻风分枝杆菌感染易感个体，特异性破坏皮肤与外周神经系统，晚期可致残的一种慢性肉芽肿性传染病[1,2]。全球每年报道的新发麻风患者超过20万例。2014年，中国新增麻风患者823例，其中包括复发患者53例[3]。

麻风的临床表现多种多样，呈“光谱”状分布。据此，Ridley-Jopling分型将麻风划分出两个迥然不同的极型，即“结核样型麻风”和“瘤型麻风”，两极型间

还存在广阔的中间类型[4]。自分型理论提出后，Th1、Th2细胞应答机制被研究者们用来解释麻风多样的临床表现，它们通过分泌不同的细胞因子，决定了麻风发展为多种临床类型的方向[5]。

结核样型麻风患者组织中以Th1型细胞因子为主，如IL-2、IFN-γ和TNF-α等[5]。IL-2能诱导单核细胞迁移到真皮中，增强机体对抗麻风分枝杆菌的细胞免疫应答；IFN-γ作为Th1细胞主要效应因子，能够激活抗原提呈细胞，通过上调转录因子T-bet而促进Th1细胞分化；同时，IFN-γ和TNF-α协同控制病原菌感染，在结核分枝杆菌感染中，抑制TNF-α发挥作用会导致潜伏性肺结核复发[6,7]。瘤型麻风患者体内缺乏麻风分枝杆菌特异性的细胞免疫，组织中以Th2型细胞因子为主[5]。Th2细胞分泌IL-4、5、6、10等细胞因子，能够刺激B细胞增殖并产生IgG、IgE等抗体，通过抗原抗体结合发挥免疫效应达到抗感染目的，IL-10还能与诱生型一氧化氮合酶相互作用参与麻风中T细胞免疫反应引起的神经损伤[8]。Th17细胞是近年来发现的除Th1、Th2外第三种T辅助细胞群，IL-17是其分泌的最主要的细胞因子，有研究发现，它们在自身免疫性疾病及感染性疾病中发挥重要作用。特别是在感染性疾病中，IL-17通过诱导中性粒细胞活化，有效介导了炎症反应，Th17细胞则在分枝杆菌感染中参与肉芽肿的形成[9]。

MDT联合化疗方案的推广，使得麻风发病率明显下降[3]。但判愈后患者体内免疫相关细胞因子是否恢复至正常水平，麻风复发及后续发生的I型和II型麻风反应是否与之相关，这些问题曾一度成为科学家们的研究热点。Joshi等[10]发现多菌型麻风患者治疗后体内会产生部分IFN-γ和IL-2以对抗麻风分枝杆菌抗原，而未经治疗的患者体内细胞免疫处于无特异性应答的状态。Esquenazi等[11]也发现IFN-γ和IL-2水平只在治愈1～2年的患者体内升高，治愈的多菌型麻风患者体内IFN-γ水平会随着治愈年限的延长而逐渐降低，体内IL-6仍处于较高水平。治愈后复发的患者体内IL-1、6和TNF的水平较新发患者显著升高。

为客观分析各细胞因子在麻风患者血清中治疗前后的变化规律，本研究在新发麻风，治愈麻风及正常对照三组样本中检测Th1/Th2/Th17相关细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ、IL-17A在血清样本中的水平变化，分析各组间差异。

1　研究对象与方法

1.1研究对象12例麻风患者均为2015年3～9月就诊于山东省皮肤病性病防治研究所门诊的新发现麻风患者，其中男6例，女6例，年龄(52.5±17.4)岁，病程(56.5±38.0)个月。29例已判愈患者均为2015年6～9月我所随访的经规范治疗的麻风患者，其中男21例，女8例，年龄(67.1±13.9)岁，病程(84.3±73.3)个月。均经涂片查菌和病理确诊。37例正常人均为我所体检合格健康人员，无其他感染性疾病和自身免疫性疾病，其中男17名，女20名，年龄和性别与患者组无统计学差异，具可比性。

1.2标本采集与检测新发患者组、已判愈患者组和正常对照组均取清晨空腹静脉血5 mL，存于无菌促凝采血管中，采集后2 h内进行离心，分离出血清后置于血清冻存管中-80℃冰箱保存备用。

主要试剂及仪器：试剂为BD Cytometric Bead Array Human Soluble Protein Master Buffer Kit(IL-1)、Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit，仪器为FACS Verse流式细胞仪，检测使用CellQuest自动软件，数据分析采用FCAP Array分析软件，均为美国BD公司产品。

检测内容：患者组与对照组血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ、IL-17A等细胞因子。

1.3方法实验条件准备：打开流式细胞仪，进行仪器调整，从CBA kit中拿出cytometer setup beads，设定本实验所需的各种特定参数(设门，调节电压、补偿)。

标准曲线制备：依照试剂盒说明书梯度稀释细胞因子标准品：1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256等9种浓度及空白对照。

待测样本制备：待测血清于-80℃冰箱取出后，室温静置30 min，12000 g离心5 min，取上清50 μL于待测管中。Human Soluble Protein Master Buffer Kit(IL-1)试剂盒操作步骤：①在12×75 mm流式上样管中各加入50 μL待测血清；②每管加入50 μL混合微球；③轻柔混匀，室温孵育1 h；④每管加入50 μL PE标记的检测抗体；⑤轻柔混匀，室温孵育2 h。⑥每管加入1 mL洗液清洗样本，200 g离心5 min；⑦小心吸去或轻柔倒掉上清液，每管加入300 μL洗液重悬微球。Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit试剂盒操作步骤：①在12×75 mm流式上样管中各加入50 μL混合好的捕获微球；②每管加入50 μL待测血清；③每管加入50 μL人Th1/Th2/Th17 PE检测试剂；④室温避光孵育3 h；⑤每管加入1 mL洗液，200 g离心5 min；⑥小心吸去上清，每管加入300 μL洗液重悬微球。上机检测与分析：涡旋充分混匀(约3～5 s)立即上机，自动得出标准曲线及计算结果。

1.4统计学方法应用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行统计描述和分析，正态分布的计量资料使用中位数(P50)和百分位数(P25，P75)描述；多组非正态分布资料间的比较采用Kruskal-Wallis检验，P<0.05为差异有统计学意义；组间的多重比较采用Nemenyi检验[12]，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A在新发组、治愈组和对照组的检测结果(表1)，Kruskal-Wallis检验结果显示IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、IL-17A在新发组、治愈组和对照组的浓度差异有统计学意义，IL-4、TNF在新发组、治愈组和对照组的浓度差异无统计学意义。

2.2IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A在新发组与治愈组、新发组与对照组、治愈组与对照组之间的检验结果见表2。Nemenyi检验结果示IL-1、IL-2在新发组与治愈组之间的浓度差异有统计学意义，IL-6在新发组与对照组、治愈组与对照组之间的浓度差异有统计学意义，IFN-γ、IL-17A在新发组与对照组之间的浓度差异有统计学意义，IL-10在新发组与治愈组、新发组与对照组、治愈组与对照组之间的浓度差异均无统计学意义。

表1　IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A等8种细胞因子在新发组、治愈组和对照组的检测结果

表2　Nemenyi检验新发组、治愈组和对照组的检验结果

3　讨论

结核样型麻风患者组织中以Th1型细胞因子分布为主，瘤型麻风患者体内缺乏麻风分枝杆菌特异性的细胞免疫，组织中以Th2型细胞因子分布为主[5]。Madan等[13]发现，新发麻风患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-10水平显著高于正常对照组；结核样型麻风患者血清中TNF-α、IFN-γ水平较正常对照组显著升高；瘤型麻风患者血清中IL-1β、IL-10水平较正常对照组显著升高。Moubasher等[14]的研究结果也支持这一现象，瘤型麻风患者血清中IL-1β(88.5±44.83)pg/mL、IL-2R(3150±2194.82)pg/mL和IL-10(102.16±25.69)pg/mL水平显著高于对照组IL-1β(10.93±3.07)pg/mL、IL-2R(775.55±233.69)pg/mL和IL-10 (32.05±7.65)pg/mL。

IFN-γ可以激活机体的抗菌机制，通过诱导诱生型一氧化氮合酶的生成，导致一氧化氮的产生，后者通过对靶细胞的毒性作用发挥杀伤作用[15]。IFN-γ还可以诱导巨噬细胞分泌TNF-α，两者在结核样型麻风患者体内高表达证明了IFN-γ和TNF-α在机体杀灭病原菌和肉芽肿形成中起到了免疫保护作用[13]。此外，TNF-α可能会直接损伤髓鞘和少突胶质细胞，也有刺激骨质吸收、抑制骨胶原蛋白合成的作用。TNF-α的这些功能可为麻风患者出现的神经损伤及畸残等临床表现提供合理解释[16]。麻风杆菌侵染机体后，活化的巨噬细胞可分泌IL-1，它能够增强NK细胞的活性，对中性粒细胞、巨噬细胞以及淋巴细胞，特别是Th2细胞有趋化和增强的作用，同时促进IL-2的分泌，在麻风免疫反应中起重要作用[14,17]。IL-2也称为T细胞生长因子，Kaplan等[6]为14例瘤型麻风患者注射重组IL-2后，监测到患者体内麻风杆菌BI指数与PGL-1水平显著下降，单核细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞等显著升高。

Th17细胞亚群的发现，弥补了Th1/Th2介导效应机制的不足[18]。IL-17A作为其最主要的效应因子，具有强大的致炎性，能刺激IL-6和前列腺素E2的生成，增强局部炎症，同时通过上调IL-1β、IFN-γ等炎症细胞因子的基因表达，促进局部炎症的进展和扩大[19]。Th17细胞不但能促进炎性反应，而且加强了机体的防御功能。Saini等[20]认为在机体无力启动Th1型细胞免疫应答或Th0细胞未完成向Th1、Th2细胞分化时，Th17细胞可能作为一种替代途径达到杀灭病原菌的目的。

本研究发现，新发麻风患者血清IL-1、IL-2细胞因子表达水平显著高于治愈患者，此结果与Moubasher等[14]发现的新发麻风患者血清中IL-1β(56.14±30.92)pg/mL、IL-2R(1 855.55±1 222.95)pg/mL和IL-10(81.44±32.69)pg/mL水平显著高于治疗后患者血清中IL-1β(20.25±12.31)pg/mL、IL-2R(1049.44±748.03)pg/mL和IL-10(49.17±20.98)pg/mL水平一致。原因可能为在麻风患者体内，免疫系统经麻风分枝杆菌抗原刺激后产生了过多的细胞因子，但经过MDT多药联合化疗后，麻风分枝杆菌被消灭，抗原的去除使得细胞因子的分泌减少甚至恢复到正常对照的水平。此外，联合化疗的药物中，氯法齐明和氨苯砜均具有强大的抑菌抗炎作用，联用可以大幅度减少相关细胞因子的分泌。

本研究还发现新发麻风患者血清IFN-γ、IL-17A细胞因子表达水平显著高于正常对照组，这与de Almeida-Neto等[9]的研究结果一致，发现IFN-γ和IL-17A在麻风患者体内呈正相关，同时在与其他细胞因子协同控制感染的过程中也呈正相关，由此说明Th1、Th17细胞在麻风分枝杆菌侵染后机体的免疫应答过程中起重要作用。

本研究证实了IL-1、IL-2、IFN-γ和IL-17A在新发麻风患者血清中的高水平表达，预示着以上细胞因子在麻风发病免疫反应过程中的重要作用。同时，没有发现IL-4、IL-10和TNF-α等细胞因子在新发患者组、治愈患者组与正常对照组之间有显著差异，这可能与实验样本量不足、治愈患者年代久远等因素有关。由此可知，Th1、Th2、Th17细胞及相关细胞因子确实参与了麻风发生、发展的免疫应答，且多药联合化疗在杀灭麻风分枝杆菌同时对机体免疫状态也会产生影响，此外，多种细胞因子在外周血中浓度的变化对临床麻风患者的病情评估，治疗及疾病预后有一定的参考及指示价值。

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(收稿：2016-03-31)

Detection of serum Th1, Th2 and Th17 related cytokines in the patients with leprosy

LIJianke1,2,WANGChuan2,LIFurong2,CHUTongsheng2,LIUDianchang2,YUXiulu2,LIUHong2,ZHANGFuren2.

1.SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062 ,China; 2.ShandongProvincialInstituteofDermatologyandVenereology,Jinian250022,China

Correspondingauthor:ZHANGFuren,E-mail:zhangfuren@hotmail.com

Objective: To detect the levels of Th1, Th2 and Th17 related cytokines in the patients with leprosy and to explore the role of those cytokines in leprosy. Methods: The serum levels of IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ and IL-17A were detected by flow cytometric bead array in 12 newly reported leprosy patients, 29 cured leprosy patients and 37 healthy controls. The differences between groups were compared by Kruskal-Wallis test and Nemenyi test. Results: The levels of IL-1 and IL-2 in newly reported leprosy patients were higher than that in cured leprosy patients, with significant difference (P<0.005). The levels of IL-6 in newly reported leprosy patients and cured leprosy people were higher than those in healthy controls (P<0.005). The levels of IFN-γ and IL-17A in newly reported leprosy patients were higher than those in healthy controls (P<0.005). There was no difference in the levels of IL-4，IL-10 and TNF among newly reported leprosy patients, cured leprosy patients and healthy controls. Conclusion: Th1, Th2 and Th17 related cytokines may be associated with the development of leprosy.

leprosy; cytokines; flow cytometric bead array

1济南大学 山东省医学科学院 医学与生命科学学院,济南,250062

2山东省皮肤病性病防治研究所,济南,250022

张福仁，E-mail: zhangfuren@hotmail.com