纳豆激酶高产菌株的选育及固态发酵技术

张 杰，葛武鹏,*，陈 瑛，张 悦，刘李婷

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省质量技术监督局，陕 西 西安 710068；3.陕西省产品质量监督检验研究院，陕西 西安 710068）

纳豆激酶高产菌株的选育及固态发酵技术

张 杰1，葛武鹏1,*，陈 瑛2，张 悦3，刘李婷3

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省质量技术监督局，陕 西 西安 710068；3.陕西省产品质量监督检验研究院，陕西 西安 710068）

以枯草芽孢杆菌为出发菌株，选用超声波和紫外线进行诱变处理，根据致死率、突变率与诱变剂量的关系选择合适的诱变剂量，以筛选高产纳豆激酶的优势菌株。实验表明：最佳诱变条件为：超声波45 kHz、2 80 W，时间60 min，紫外线照射距离30 cm，时间120 s。经多次初筛、复筛，选育出一株命名为BSCZ-4 的优势菌株，其纳豆激酶酶活力为原始菌株的1.96 倍。对该菌种进行连续20 代培养，测得其溶解圈直径稳定在18～19 mm之间，表明该突变株遗传特性稳定。并采用Box-Behnken响应曲面法优化其固态发酵工艺条件，结果为：魔芋精粉添加量5%、接种量8%，34 ℃发酵24 h，纳豆激酶活力可达（4 087.83±93.75） U/g。

诱变；枯草芽孢杆菌；响应面；工艺

纳豆是一种有着几千年历史的传统发酵食品，具有很多保健功能，如抗肿瘤、溶血栓、抗氧化、抗菌、防治骨质疏松、降血压、美容等[1]。纳豆枯草芽孢杆菌是纳豆的生产菌种，属于细菌科、芽孢杆菌属[2]，是革兰氏阳性菌[3]，具有分解蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质的能力[4]，其代谢产物纳豆激酶（nattokinase，NK）是一种丝氨酸蛋白酶[5]，由275 个氨基酸残基组成，分子质量约为28 kD。纳豆激酶较稳定，50 ℃处理或经5 次反复冻融仍能保持活性。在pH 6～12条件下稳定存在，在酸性条件下无活性[6]。经大量文献证实纳豆激酶具有多种功能[7-10]，其溶栓及抑制血栓形成效果较为突出[11-14]。

近几年，世界很多国家也都加入到纳豆的研究工作中，而国内的研究重点主要集中在通过对发酵条件的优化，从而提高纳豆激酶的活力值[15-17]。然而在此基础上得到的酶活力值并不理想，整体水平上仍有待提高。传统的诱变技术是大多数微生物育种的重要手段[18]，诱变育种通常使用两种或两种以上的手段进行复合处理，根据其复合处理的协调作用以提高诱变效应。本研究从生产菌种出发，通过对纳豆枯草芽孢杆菌菌体进行超声波和紫外线复合诱变处理，筛选出纳豆激酶产量明显提高的突变株，并经传代20 次证明其遗传稳定性，可作为发酵的优良菌种。并采用Box-Behnken响应曲面法优化其固态发酵工艺条件，得到高产纳豆激酶的工艺参数，以期为纳豆菌高产纳豆激酶提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

枯草芽孢杆菌枯草亚种BS21076 中国工业微生物菌种保藏管理中心。

尿激酶 北京雅安达生物技术有限公司；凝血酶（1 000 U/支）、牛纤维蛋白原 美国Sigma公司。

1.2 培养基

牛奶初筛培养基：脱脂奶粉60 g、牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g、琼脂15 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。

液体种子培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。

发酵基础培养基[19]：葡萄糖15 g、蛋白胨15 g、Na2HPO42 g、NaH2PO42 g、MgSO40.5 g、CaCl20.2 g，蒸馏水1 L，pH 7.2～7.4。

1.3 仪器与设备

DRP-9162电热恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司；SW-CJ-2D型（实用垂直新颖）双人净化工作台苏州净化设备有限公司；ES-315高压蒸汽杀菌锅 上海博迅实业有限公司；精密pH仪 德国赛多利斯公司；SPH-200B摇床 西安禾普生物科技有限公司；HC-3018高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；SB-5200DT超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌悬液的制备[20]

用接种环挑取斜面菌种两环，接种于装有100 mL液体种子培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃、150 r/min摇床培养15 h。将制备好的种子液装入离心管5 000 r/min离心20 min，倒去上清液，将菌泥用灭菌的生理盐水洗2～3 次，然后调整菌悬液浓度为106～107个/mL。

1.4.2 超声波处理

将20 mL的菌悬液置于50 mL三角瓶中，放入超声波清洗机。超声波工作条件为 45 kHz、280 W、220 V，对菌悬液依次诱变处理0、10、20、30、40、50、60、70、80 min，取诱变后的菌悬液将其稀释涂布于固体培养基平板上，每组2 个平行，培养24 h，统计菌落，计算致死率。

1.4.3 紫外诱变处理

将菌悬液稀释后均匀地涂布在固体培养基上，紫外灯（照射距离为30 cm）预热30 min后，照射涂布了枯草芽孢杆菌悬液的固体培养基[21]。照射时间分别为0、30、60、90、120、150、180、210、240 s。照射结束后用黑布包裹，37 ℃培养24 h，统计菌落总数，计算致死率。

1.4.4 致死率的计算

致死率的计算见式（1）[22]。

式中：A为未经处理的平板菌落数/（CFU/mL）；B为与A平行经诱变处理后的再生菌落数/（CFU/mL）。1.5 菌种诱变流程

出发菌→超声波处理→初筛→复筛→紫外照射→初筛→复筛→高产纳豆激酶菌株

1.6 筛选方法

1.6.1 初筛

将诱变菌株和原始菌株分别培养后，用接种环点样于脱脂牛奶初筛培养基上，于37 ℃培养18 h后，以原始菌株作为对照组，测定并计算溶解圈直径与菌落直径的比值，选取正突变株（即牛奶初筛平板溶解圈直径与菌落直径比值比对照菌株溶解圈直径与菌落直径比值增大10%的菌株），计算正突变率。正突变率的计算见式（2）[23]。

式中：A为点样菌落数/（CFU/mL）；B为突变株菌落数/（CFU/mL）。

1.6.2 复筛

将通过初筛方法所得到的突变菌株经种子液培养（37 ℃、150 r/min、15 h）后，按4%的接种量转入10 mL的液体发酵培养基中，在37 ℃、150 r/min条件下摇瓶培养72 h后，分别经琼脂糖-纤维蛋白平板测量溶解圈直径并计算纳豆激酶活力。

1.7 遗传稳定性测定

经过初筛、复筛实验结束后，将筛选得到的最优突变菌株进行传代实验，传20 代并每隔2代进行摇床发酵实验（37 ℃、150 r/min条件下摇瓶培养72 h），然后采用琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纳豆激酶酶活力以考察突变菌种的遗传稳定性。

1.8 纳豆激酶活性测定

纳豆激酶活性测定参照Astrup等[24]的方法，制备纤维蛋白平板并进行改进。取3 mL配制好的纤维蛋白原溶液放入长试管中于37 ℃保存备用。在直径9 cm培养皿中，用1 000 μL的移液枪加入1 mL 20 U/mL凝血酶，再加入2 mL工作液，摇匀。将配制好的琼脂糖溶液取10 mL加入放有纤维蛋白原溶液的试管中，摇晃几下倒入培养皿中，按逆时针方向匀速转圈摇晃培养皿，以确保溶液充分混合均匀，并保持无气泡。将尿激酶标准品用生理盐水配制成200、400、600、800、1 000 U/mL 5 个浓度梯度，分别取5 μL加入已制备好的琼脂糖-纤维蛋白原平板中，放入恒温培养箱中37 ℃孵育18 h，测量溶解圈垂直直径，计算溶解圈面积。以溶解圈面积为纵坐标，酶活力为横坐标做标准曲线。取样品5 μL加入纤维蛋白平板中，37 ℃孵育18 h，测量溶解圈垂直直径，根据标准曲线测定样品酶活力。

1.9 固态发酵最佳条件确定

1.9.1 产酶条件单因素试验

以筛选出高产纳豆激酶的突变株为生产菌株，采用固态发酵方式进行发酵条件优化，包括发酵温度、发酵时间、接种量、魔芋精粉添加量。

1.9.2 Box-Behnken响应面设计

在单因素试验的基础上选择发酵温度、发酵时间、魔芋精粉添加量作为3 个显著影响因素，采用Box-Behnken响应面试验设计方法，以纳豆激酶酶活力为响应值对显著因素进行优化。

2 结果与分析

2.1 超声波诱变

任何诱变剂都具有致死和诱变的双重效应[25]，因此测定枯草芽孢杆菌经超声波处理后的致死率曲线，以确定最佳诱变时间，根据超声波处理后菌落生长状况测得菌体的致死率见图1。随着超声波时间的延长，枯草芽孢杆菌的致死率相应提高，当诱变时间80 min时，致死率达到91.00%，同时计算不同诱变处理下的正突变率。由图1可知，当超声波诱变时间在60 min时，正突变率明显高于其他值，达到44.66%，这可能是由于诱变时间延长，超声波对细胞的作用增加，使得突变率提高。根据致死率和突变率两个指标，确定超声波诱变时间为60 min。

图1 BS21076超声波诱变致死曲线Fig.1 Death and mutation rates of BS21076 subjected to ultrasonic treatment

2.2 超声波诱变下突变株的筛选

2.2.1 初筛

将103 株突变菌株与原始菌株点样于牛奶初筛平板上，37 ℃培养18 h，测定并计算其溶解圈直径与菌落直径的比值，经过与原始菌株的比较选取正突变株，最终得到46 株。为了确保正突变株能生产高活力的纳豆激酶，对46 株突变株进行复筛。

2.2.2 复筛

采用摇床发酵法并结合琼脂糖-纤维蛋白平板法测定，将初筛得到的46 株菌株经37 ℃、150 r/min的摇瓶发酵72 h后，采用琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活力，以原始菌株的发酵液中酶活力为对照，筛选出酶活力最高的菌株，最终确定编号BSC-2菌株活力最高。

2.3 紫外诱变

图2 BSC-2紫外诱变致死曲线Fig.2 Death and mutation rates of BSC-2 subjected to UV treatment

将筛选的突变株BSC-2进行紫外线诱变处理，结果见图2。随着紫外照射时间延长，致死率逐渐增大，较超声波致死曲线相比，增加速率较为平缓。当照射时间为150 s时，致死率达到了90.31%。计算不同紫外线处理时间下正突变率，结果见图2。120 s时正突变率为49.33%，明显高于其他诱变剂量，故采用120 s作为紫外诱变最佳处理时间。

2.4 紫外诱变下突变株的筛选

将BSC-2经紫外诱变处理后的突变株，用接种环点样于牛奶初筛平板上，通过与原始菌株BSC-2对比，最终从75 株突变株中筛选出37 株，然后对其进行摇瓶复筛。通过比较溶解圈直径计算出纳豆激酶酶活力，最终确定1 株产酶活力较高的菌株，编号为BSCZ-4。

2.5 遗传稳定性

经过初筛、复筛实验最终得到一株产酶活性较高的菌株，为了验证突变株的遗传稳定性，将产酶活力较高的1 株突变株BSCZ-4连续传代20 次，采用琼脂糖-纤维蛋白平板法每隔2 代测定其产酶活力。由图3可知，突变株的每代产生的溶解圈直径比较稳定，基本维持在18～19 mm之间，说明突变株BSCZ-4具有良好的遗传稳定性，可作为优势菌株进行后续发酵。

图3 突变株遗传稳定性Fig.3 Genetic stability of mutant strain BSCZ-4

2.6 固态发酵最佳工艺条件优化

2.6.1 不同发酵温度对纳豆激酶酶活性的影响

微生物在发酵过程中适宜的温度也是保证酶活力的一个主要因素，因此研究不同发酵温度对纳豆激酶酶活力的影响，结果见图4。发酵温度对其产酶活力影响显著，随着发酵温度的升高，所产生的纳豆激酶酶活力呈现先升高后减小的趋势。当温度达到37 ℃时，所得到的纳豆激酶酶活力达到最大，为（3 414.97±16.25） U/g。由多重比较分析结果可知，各因素间存在显著性差异。

图4 不同发酵温度对纳豆激酶酶活力的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on the activity of nattokinase

2.6.2 不同发酵时间对纳豆激酶酶活力的影响

由图5可知，随着发酵时间的延长，产生的纳豆激酶酶活力呈现先增大后减小的趋势。当发酵时间为24 h时，纳豆激酶酶活力明显高于其他值，为（3 413.71±45.53） U/g。这是由于在发酵过程中，首先微生物数量不断增长，随后代谢产物将不断积累。但随着菌体的不断衰老，其代谢产物相对比较复杂，当发酵时间继续延长时，代谢产物酶活力有下降趋势。

图5 不同发酵时间对纳豆激酶酶活力的影响Fig.5 Effect of fermentation time on the activity of nattokinase

2.6.3 不同接种量对纳豆激酶酶活力的影响

图6 不同接种量对纳豆激酶酶活力的影响Fig.6 Effect of inoculums amount on the activity of nattokinase

由图6可知，当接种量过低时（≤4%），纳豆激酶酶活力相对较小；而当接种量过大时（10%），纳豆激酶酶活力也呈现较低的趋势。这可能是由于当接种量过低时，菌种生长繁殖相对较慢，代谢产物积累较少；而当接种量过大时，菌种繁殖快，密度过大，同时由于纳豆发酵表面产生黏状物质影响氧气供应，使得代谢产物较少。由多重比较分析结果可知，接种量4%、6%、8%、10%各因素无显著性差异，因此在响应面试验中，确定接种量为4%。

2.6.4 不同魔芋精粉添加量对纳豆激酶酶活力的影响

为了确保菌体生长以及积累更多的所需要的代谢产物，需要向纳豆固态发酵中添加碳源。由图7可知，当魔芋精粉添加量为4%时，纳豆激酶酶活力达到最大为（3 748.43±99.28） U/g。这是由于当碳源少时，影响菌体的生长及其代谢；当碳源过量时，整个发酵体系呈现低pH值的状态，影响代谢产物的积累。由多重比较分析结果可知，因素间存在显著性差异。

2.6.5 Box-Behnken响应面试验设计

表1 Box-Behnken响应面试验设计方案及结果Table1 Experimental design and results for Box-Behnken response surface analysis

对上述试验结果进行二次回归拟合，建立的回归方程如下：

表2 二次响应面模型方差分析Table2 Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic mooddeell

由表2方差分析结果可看出，模型极显著（P＝0.000 7＜0.01），失拟项不显著（P＝0.405 6＞0.05），说明该模型拟合程度良好，可用于纳豆激酶发酵工艺条件的分析和预测。对回归系数显著性检验可知，一次项X3、二次项之间的交互作用对纳豆激酶酶活力的影响极显著，X1、X2对纳豆激酶酶活力的影响显著，而X1X2、X32、X2X3之间的交互作用对纳豆激 酶酶活力的影响均不显著。

图8 发酵温度与魔芋精粉添加量的交互作用对纳豆激酶酶活力的影响Fig.8 Interactive effects of fermentation temperature and kjonjac powder concentration on the activity of nattokinase

图9 发酵时间与魔芋精粉添加量的交互作用对纳豆激酶酶活力的影响Fig.9 Interactive effect of fermentation time and konjac powder concentration on the activity of nattokinase

图10 发酵温度与发酵时间的交互作用对纳豆激酶酶活力的影响Fig.10 Interactive effects of fermentation temperature and time on the activity of nattokinase

根据回归方程得出不同因素的响应面分析图及等高线图结果见图8～10。各参数间的等高线呈椭圆形，响应值存在最大值。利用Design-Expert 8.0.5.0软件求解方程最大值，当发酵温度为34 ℃、发酵时间为24 h、魔芋精粉添加量为5%时，纳豆激酶酶活力最高为4 066.0 U/g。为了检验模型的准确性，在最佳发酵条件下进行发酵实验，两次实验得纳豆激酶酶活力平均值为（4 087.83±93.75） U/g，表明所得的模型具有一定的实验指导意义。

3 结 论

采用超声波与紫外线对枯草芽孢杆菌进行诱变处理，超声波处理条件为45 kHz、280 W，处理时间60 min，紫外线处理条件为照射距离为30 cm，照射时间120 s。经平板初筛和摇床复筛，并进行遗传稳定性实验，最终选育出一株产纳豆激酶活力较高的菌株BSCZ-4。

利用响应面设计优化了纳豆固态发酵工艺条件，建立了固态发酵工艺数学模型，得到了较合适的工艺条件为发酵温度为34 ℃、发酵时间为24 h、魔芋粉添加量为5%时，纳豆激酶酶活力最高为（4 087.83±93.75） U/g。验证实验发酵得到的纳豆激酶酶活力与模型预测值4 066.0 U/g基本一致，证明该模型的可靠性良好。

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Strain Improvement of Bacillus subtilis for Enhanced Production of Nattokinase and Optimization of Solid-State Fermentation Conditions

ZHANG Jie1, GE Wupeng1,*, CHEN Ying2, ZHANG Yue3, LIU Liting3
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Bureau of Quality and Technical Supervision, Xi’an 710068, China; 3. Shaanxi Product Quality Supervision and Inspection Research Institute, Xi’an 710068, China)

In this study, the nattokinase-producing capacity of Bacillus subtilis subsp. subtilis BS21076 was improved by sequential mutagenization with ultrasonic followed by UV light at the appropriate doses determined according to death and mutation rates. The optimal mutation conditions of strain BS21076 were established as 60 min ultrasonic treatment at 45 kHz and 280 W followed by 120 s UV irradiation at a distance of 30 cm. A high nattokinase-producing mutant strain named BSCZ-4, producing 1.96 times higher nattokinase than BS21076, was obtained after several rounds of primary and secondary screening. After 20 consecutive passages, the diameter of the zone of dissolution produced by BSCZ-4 remained stable in the range of 18–19 mm, suggesting good genetic stability. Using Box-Behnken response surface methodology, the optimal culture conditions for the enhanced production of nattokinase by BSCZ-4 in solid-state fermentation were determined as addition of 5% konjac power to the culture medium, an inoculum size of 8%, and 24 h culture at 34 ℃, resulting in a nattokinase activity of (4 087.83 ± 93.75) U/g.

mutation; Bacillus subtilis; response surface methodology; process

10.7506/spkx1002-6630-201603028

TS201.3

A

1002-6630（2016）03-0151-06

张杰, 葛武鹏, 陈瑛, 等. 纳豆激酶高产菌株的选育及固态发酵技术[J]. 食品科学, 2016, 37(3): 151-156. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603028. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Jie, GE Wupeng, CHEN Ying, et al. Strain improvement of Bacillus subtilis for enhanced production of nattokinase and optimization of solid-state fermentation conditions[J]. Food Science, 2016, 37(3): 151-156. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603028. http://www.spkx.net.cn

2015-03-19

国家重点星火计划项目（2013GA850003）

张杰（1989—），女，硕士研究生，研究方向为生物技术。E-mail：zjzj89zjzj@163.com

*通信作者：葛武鹏（1965—），男，副教授，博士，研究方向为乳品科学及生物技术。E-mail：josephge@sina.com