益气活血解毒方对血管损伤后外膜早期炎症和血管重构的影响

杨瑞薛，赵明镜，雷 环，常 宏，赵一舟，吴爱明，杨 涛，韩小婉，王 蕾，李 彤



·基础医学论著/研究·

益气活血解毒方对血管损伤后外膜早期炎症和血管重构的影响

杨瑞薛，赵明镜，雷 环，常 宏，赵一舟，吴爱明，杨 涛，韩小婉，王 蕾，李 彤

目的 观察球囊损伤血管内膜后外膜早期炎症和血管重构的变化及益气活血解毒方对其的影响。方法 实验采用球囊导管拉伤大鼠左侧颈总动脉内膜模型，造模动物随机分为模型组、阿托伐他汀组、血府逐瘀组和益气活血解毒组，另以假手术组作对照。灌胃给药7 d后取材，行HE染色，观察血管壁各层面积和厚度的变化，免疫组织化学染色，观察血管壁各层单核细胞趋化因子-1(MCP-1)及巨噬细胞特异性标志物CD68表达的变化。结果 与假手术组比较，模型组血管内膜面积明显增大(P<0.01)，外膜变厚(P<0.05)，管腔变化不明显，CD68的含量显著升高(P<0.05)。与模型组相比，益气活血解毒方明显减少血管内膜的面积(P<0.05)，降低CD68的含量(P<0.01)。与血府逐瘀组相比，益气活血解毒组外膜厚度明显降低(P<0.05)。结论 球囊损伤大鼠颈总动脉早期，血管以正性重构为主，外膜增厚和炎症反应明显；益气活血解毒方能有效改善血管重构，可能与其能降低巨噬细胞浸润，抑制外膜炎症反应有关。

血管重构；球囊损伤；炎症反应；益气活血解毒方

血管重构性疾病，包括高血压、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等，严重威胁着人类健康，是仅次于肿瘤的第二大致死因素。虽然这些疾病的病因有所不同，但血管重构为它们共同的病理改变。炎症参与血管重构的早期反应[1]，在血管成形术后再狭窄、高血压和动脉粥样硬化等疾病中发挥重要作用[2-4]，而炎症因子如单核细胞趋化因子-1(MCP-1)及巨噬细胞(CD68为其特异性标志物)促进血管重构性疾病的发生发展[5-6]，尤其在血管内膜损伤的早期，外膜炎症促进血管外膜成纤维细胞的活化、增殖和迁移。本研究采用球囊损伤大鼠颈总动脉模型，致血管内皮损伤，观察损伤术后7 d，血管内中外膜面积和厚度的变化及各层MCP-1、CD68含量的变化，以探讨益气活血解毒方是否通过抑制球囊损伤后早期炎性反应防治血管重构。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性SD大鼠80只，体重380 g～420 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2012-0001]，在北京中医药大学SPF级动物房饲养。

1.2 药物 益气活血解毒方：由黄芪、丹参、金银花等组成，制成药物浓度为1.2 g生药/mL的水煎剂；血府逐瘀胶囊：天津宏仁堂药业有限公司，每粒0.4 g，批号：国药准字Z12020223；阿托伐他汀钙片(立普妥)：辉瑞制药有限公司生产，每片20 mg，批号：国药准字J20070061；低分子肝素钠(吉派林)：杭州九源基因工程有限公司，每瓶0.3 mL，批准文号：国药准字H19990035；戊巴比妥钠：北京化学试剂公司，进口分装，批号：020919；青霉素钠：华北制药股份有限公司，每瓶8×105U，批号：D0801320。

1.3 主要实验试剂 CD68抗体(小鼠来源、单克隆抗体，标记巨噬细胞)：Santa Cruz Biotechnology Inc.，100 μg/mL ，货号：sc-59103；MCP-1抗体(兔来源、多克隆抗体)：Abcam公司，50 μg，货号：ab7202；免疫组化试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 主要仪器 自动脱水、透明、浸蜡机：德国Leica公司，型号：ASP300；包埋机：德国Leica公司，型号：EG1140H；病理切片机：德国Leica公司，型号：RM2135；摊片机：德国Leica公司，型号：HI1210；烘片机：德国Leica公司，型号：HI1220；显微镜：日本OLYMPUS公司，BX60型显微镜；SPOT software V3.0 Ⅱ图像拍摄系统：美国DIAGNOSTIC INSTRUMENTS公司。

1.5 球囊导管 美国Medtronic公司，规格：2 mm×20 mm。

1.6 实验方法

1.6.1 球囊损伤大鼠颈总动脉造模方法 每只大鼠术前1 h按500 U/kg于背部皮下深部注射吉派林，1 h后1%戊巴比妥钠40 mg/kg体重腹腔注射麻醉，仰卧位

颈部备皮消毒，结扎左侧颈外动脉远心端，暂时阻断颈内动脉，夹闭左颈总动脉，从左颈外动脉切口插入球囊导管至颈总动脉近心端，插入约4 cm后，以生理盐水充盈球囊(压力0.5 atm～0.7 atm)，缓慢向远心端回拉，球囊至颈总动脉分叉处泄压至0 atm，重新插入球囊导管至相同部位，如此反复操作3次。撤除球囊导管，结扎左颈外动脉近心端，开通颈总动脉、颈内动脉血流，缝合伤口。以上手术过程均为无菌操作。术后每只大鼠腹腔注射青霉素4×105U/d ，共3 d，皮下深部注射吉派林500 U/kg，共2 d。假手术组不插入球囊导管做拉伤处理，其余步骤相同。

1.6.2 动物分组及给药 造模动物随机分为模型组、阿托伐他汀组、血府逐瘀组和益气活血解毒组，以假手术组作为对照。术后第2天开始给药，连续灌药7 d。阿托伐他汀组大鼠按13.33 mg/kg给药，血府逐瘀组按0.8 g/kg给药，益气活血解毒组药物按12 g/kg生药/mL给药，均相当于人临床用量10倍，各组动物给药体积均为10.0 mL/(kg·d)。假手术组和模型组给等体积生理盐水。

1.6.3 取材及标本制作 术后第7天，常规腹腔麻醉大鼠，经心脏灌流固定组织，取损伤左侧颈总动脉(从手术动脉夹损伤外的近心端到锁骨之间的颈总动脉)，置于4%多聚甲醛固定48 h。常规制备蜡块和病理切片。

1.6.4 HE染色及分析 病理切片经脱蜡、乙醇水化、苏木素-伊红染色、乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片等步骤制成HE染色标本。通过图像拍摄系统获取照片(10×)后，使用图像分析软件(Image pro-Plus 6.0)计算形态学指标：管腔面积、管壁面积(血管总面积-管腔面积)、血管总面积[(血管外周长/2π)2×π]、内膜面积(内弹性膜围绕面积-管腔面积)、中膜面积(外弹性膜围绕面积-内弹性膜围绕面积)、中膜厚度(外弹性膜周长/2π-内弹性膜周长/2π)、外膜厚度(血管外周长/2π-外弹性膜周长/2π)。

1.6.5 免疫组织化学染色及分析 病理石蜡切片经脱蜡、乙醇水化、抗原修复、3%H2O2灭活内源性过氧化物酶、一抗4 ℃过夜(MCP-1浓度1∶100，CD68浓度1∶50，PBS稀释)、二抗37 ℃孵育、DAB显色、乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封片等步骤，制成免疫组化标本。使用图像拍摄系统在40倍镜下选取3个最能反映整个血管全貌的视野，图像分析软件测量平均光密度及总光密度(阳性面积百分比×平均光密度)，取3个视野的平均值作为最终结果。

2 结 果

2.1 血管壁面积、管腔面积与血管总面积的变化 球囊损伤后7 d，模型组及各药物组血管壁面积较假手术组增大，其中模型组与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、阿托伐他汀组及血府逐瘀组管腔面积较假手术组有轻微缩小，益气活血解毒组与假手术组相比管腔无明显缩小，但比血府逐瘀组面积有显著增大(P<0.05)。其他各组与假手术组相比，血管总面积有所增大，但差异无统计学意义。详见表1。

表1 各组血管壁面积、管腔面积与血管总面积的变化(±s) mm2

2.2 血管壁各层面积和厚度的变化 球囊损伤后7 d，血管内膜不同程度增生。各药物组内膜面积有轻度减小，其中益气活血解毒组效果显著，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组相比，模型组血管外膜厚度明显增加(P<0.05)；其他各组血管中膜的厚度、面积均无明显变化；阿托伐他汀组与益气活血解毒组外膜厚度均较血府逐瘀组明显减小(P<0.05)，外膜增生程度降低。详见表2。球囊损伤左侧颈总动脉后7 d各组HE染色结果见图1。

表2 各组血管内、中、外膜面积和厚度的变化(±s)

注：A为假手术组；B为模型组；C为阿托伐他汀组；D为血府逐瘀组；E为益气活血解毒组。

2.3 血管壁各层MCP-1表达的变化 球囊损伤后7 d，血管内、中、外膜MCP-1的表达与未损伤血管比较均有增加。与模型组相比，各药物组损伤血管壁MCP-1表达的总光密度均有不同程度降低，但差异无统计学意义。详见表3。血管壁各组MCP-1的表达见图2。

表3 各组球囊损伤后7 d血管MCP-1总光密度的变化(±s)

注：A为假手术组；B为模型组；C为阿托伐他汀组；D为血府逐瘀组；E为益气活血解毒组。

2.4 血管壁各层CD68表达的变化 球囊损伤后7 d，各手术组的整个血管壁CD68的表达均有不同程度增加。模型组内膜CD68稍有表达，中膜表达显著(P<0.05)，外膜表达最为明显(P<0.01)；与模型组比较，各药物组内膜、中膜、外膜CD68的表达均不同程度下降，血府逐瘀组与益气活血解毒组血管外膜CD68平均光密度明显低于阿托伐他汀组和模型组(P<0.05或P<0.01)，益气活血解毒组中膜CD68水平也明显低于模型组(P<0.01)。详见表4。各组血管壁CD68的表达见图3。

表4 球囊损伤后7 d各组血管CD68平均光密度的变化(±s)

注：A为假手术组；B为模型组；C为阿托伐他汀组；D为血府逐瘀组；E为益气活血解毒组。

3 讨 论

3.1 外膜炎症反应促进血管重构 血管重构是指血管管腔内径的变化或血管壁结构的改变，即血管腔/壁比例和几何形状的改变，其分为扩张型重构(正性重构)和收缩型重构(负性重构)[7]。正性重构是血管通过代偿性扩张以防止管腔狭窄，管腔内径变化不明显；负性重构是指血管代偿不足或血管收缩和内膜增生导致管腔狭窄，管腔内径变小[8]。血管内膜损伤后同时伴随外膜的早期炎症反应[9]，炎细胞浸润和产生的大量炎性因子。血管外膜炎症除引起内皮功能的失调和平滑肌细胞的增生[10]，还促进外膜成纤维细胞活化成肌成纤维细胞，肌成纤维细胞大量增殖，造成球囊损伤早期外膜增厚，炎症反应还同时促使成纤维细胞与平滑肌细胞向内膜迁移，共同参与血管重构[11]。本研究通过建立球囊损伤大鼠颈动脉模型，观察术后早期(7 d)血管重构的变化，结果发现：模型组血管壁面积明显增大、内膜轻度增厚、外膜增生明显，而管腔面积无明显变化，表明球囊损伤后早期的血管重构主要为正性重构。

血管内膜损伤后伴随外膜的早期炎症反应，外膜中有大量的巨噬细胞、中性粒细胞浸润及炎性介质的释放[12]。MCP-1属于趋化细胞因子家族成员之一，可趋化和激活单核细胞、巨噬细胞和嗜碱性粒细胞，这些聚集的细胞又进一步促进MCP-1的产生。 MCP-1使单核细胞趋化并聚集于内膜下，刺激平滑肌细胞增殖和迁移，是血管成形术后血管重构过程中重要的炎性因子之一[13]。成纤维细胞是外膜的主要细胞成分，是血管壁炎症反应的重要参与者，可分泌大量炎症因子，尤其是MCP-1。MCP-1促进单核细胞趋化至外膜，与外膜成纤维细胞相互作用后，促使成纤维细胞大量增殖[14]，导致外膜增厚，进一步促进血管重构发生发展。本研究发现：球囊损伤血管后7 d，模型组管壁内膜、中膜、外膜MCP-1的表达均增加，以外膜增加最为明显，且外膜浓度明显高于中膜和内膜，说明球囊损伤术后，血管各层细胞分泌MCP-1增加，产生炎症反应，外膜尤为明显。巨噬细胞作为重要的炎症细胞于术后1 d～7 d大量浸润至血管壁，外膜的巨噬细胞含量高于中膜和内膜，这就进一步加重了外膜的炎症反映。

3.2 益气活血解毒方的作用 中医对血管损伤后再狭窄等血管重构性疾病进行了长期的探索，活血化瘀是防治该病的基本中医治则，并对血府逐瘀汤及芎芍胶囊进行了大量的临床和基础研究，取得了明显的研究效果[15-16]。研究证实：血府逐瘀汤有抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移和侵袭的作用，达到防治动脉粥样硬化和血管再狭窄的目的[17]。我国第一代著名中西医结合心血管病专家廖家桢教授认为：再狭窄的中医病因病机除血瘀外，还有全身和血管损伤部位的气虚，同时血管成形术可导致局部气血凝滞、经络阻塞，毒邪壅遏，病变部位可出现炎细胞浸润、渗出及增生等，成为中医学中的“内生之毒”。这些内生之毒蕴积局部及全身，导致再狭窄的发生。所以提出益气活血解毒的治则及其方药，益气活血解毒方在活血化瘀的基础上加用补气和解毒药，该方由黄芪、丹参、金银花等组成，黄芪补气，丹参活血祛瘀通脉，金银花清热解毒，体现了益气活血解毒这一基本治法。现代药理学证明：黄芪多糖具有抗炎活性和免疫调节作用[18]；丹参具有抗纤维化作用，可抑制成纤维细胞活化和分泌[19]；金银花有效成分绿原酸能清除自由基及抗脂质过氧化，以保护血管内皮细胞[20]，同时还具有抗炎作用。这些药物综合作用在防治血管重构性疾病中发挥作用。前期实验研究结果表明：益气活血解毒方可减少细胞外基质的沉积[21]；降低血脂水平，抑制新生内膜的增殖，减少增生内膜中胶原沉积[22]，对血管外膜有较好的作用[23]。本实验发现：益气活血解毒组能明显减少内膜面积(P<0.05)，表明对抑制新生内膜生成有较好疗效，且有一定的抑制外膜增厚的趋势。同时，益气活血解毒组可明显降低巨噬细胞特异性标志物CD68的表达，尤其抑制中膜和外膜中巨噬细胞浸润的效果明显。益气活血解毒组在增加管腔面积和减少外膜厚度方面优于血府逐瘀组；在减少巨噬细胞中膜和外膜浸润方面优于阿托伐他汀组。血府逐瘀组有较好的抑制外膜CD68作用，而阿托伐他汀组无此作用。3组药物对MCP-1总光密度均无影响。

综上所述，球囊损伤血管内膜早期，血管发生明显的炎症反应，外膜最为显著，血管主要为正性重构，外膜明显增厚。益气活血解毒方能显著降低球囊损伤后大鼠血管壁各层尤其是外膜细胞中MCP-1和CD68的含量，从而抑制外膜炎症，推测可能进一步抑制外膜成纤维细胞的增殖和迁移，进而抑制新生内膜的增生。本研究还有待于从细胞层面进一步探讨益气活血解毒方对外膜的作用机制。

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(本文编辑郭怀印)

The Infcuence of Yiqi Huoxue Jiedu Formula on Early Adventitial Inflammation and Vascular Remodeling after Vascular Injury

Yang Ruixue，Zhao Mingjing，Lei Huan，Chang Hong，Zhao Yizhou，Wu Aiming，Yang Tao，Han Xiaowan，Wang Lei，Li Tong

Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education，Dongzhimen Hospital Attached to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China Corresponding Author：Zhao Mingjing

Objective This study aims to observe early adventitial inflammation and vascular remodeling after balloon injury of vascular intima and the effect of Yiqihuoxuejiedu Formula.Methods The model of left common carotid artery balloon injury with rats was used，and model rats were randomly divided into model group，atorvastatin group，Xuefuzhuyu group and Yiqihuoxuejiedu group with sham group as the control. Seven days after dosing，the area and the thickness of the vascular wall were observeded by HE staining. The levels of monocyte chemoattractant protein1(MCP-1) and the macrophage marker CD68 were assessed by immunohistochemical staining. Results Compared with sham group，the intima area increased(P<0.01)，adventitia thickening grew(P<0.05)and the concentrations of CD68added significantly (P<0.05)，but the lumen area and integrated optical density of MC-1 did not significantly change in the model group. Compared with model group，Yiqihuoxuejiedu Formula could obviously reduce the intimal area (P<0.05) and lower CD68 level remarkably(P<0.01). Compared with Xuefuzhuyu group，Yiqihuoxuejiedu Formula could reduce adventitial thickness obviously. Conclusion The vessel wall mainly presents positive remodeling withadventitia thickening and inflammatory reaction in the early stage of common carotid artery balloon injury. Yiqihuoxuejiedu Formula can improve vascular remodeling effectivelyby the reduction of macrophage infiltration and inhibition of adventitial inflammation.

vascular remodeling；balloon injury；inflammation；Yiqihuoxuejiedu Formula

国家自然科学基金面上项目(No.81173234)

北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室国家中医药管理局心脉病证益气活血重点研究室(北京100700)

赵明镜，E-mail：mjgx2004@163.com

R331 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.19.008

1672-1349(2016)19-2230-06

2016-02-08)

引用信息：杨瑞薛，赵明镜，雷环，等.益气活血解毒方对血管损伤后外膜早期炎症和血管重构的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(19)：2230-2235.