基于VEGF调控SDF-1/CXCR4信号探讨可乐定促进滋养细胞的增殖和迁移

张 瑾 赵欣媛 张建华

西安医学院第二附属医院产二科，陕西西安710024

基于VEGF调控SDF-1/CXCR4信号探讨可乐定促进滋养细胞的增殖和迁移

张 瑾 赵欣媛 张建华

西安医学院第二附属医院产二科，陕西西安710024

目的探讨可乐定（CLO）对滋养细胞增殖、迁移的促进作用及分子机制探讨。方法不同浓度的CLO与HTR8-SVneo滋养细胞共培养，MTT和Transwell方法检测HTR8-SVneo细胞的增殖和迁移，RT-PCR和Western blot技术检测血管内皮生长因子（VEGF）、基质细胞衍生因子（SDF-1）及其趋化因子受体（CXCR4）的表达水平；将CLO分别与VEGF受体抑制剂（DC101）、CXCR4抑制剂（AMD3100）共同作用于HTR8-SVneo细胞，检测细胞的增殖、迁移能力和CXCR4的表达水平。结果CLO显著促进HTR8-SVneo细胞的增殖和迁移（P＜0.05），并上调VEGF、CXCR4的表达水平（P＜0.05）；抑制剂DC101和AMD3100均可抑制可乐定对滋养细胞增殖和迁移的促进作用，且VEGF可调控SDF-1、CXCR4的表达（P＜0.05）。结论CLO可通过VEGF激活SDF-1/CXCR4信号，促进HTR8-SVneo滋养细胞的增殖和迁移。

可乐定；HTR 8-SVneo细胞；增殖迁移；血管内皮生长因子；基质细胞衍生因子/基质细胞衍生因子趋化因子受体

妊娠高血压疾病是妊娠期特有的并发症，严重危害母婴健康，是孕产妇和胎儿发病和死亡的主要原因之一［1］。近年的研究表明，滋养层细胞通过迁移、入侵子宫内壁，促进胚胎着床稳定，完善胎盘的生长发育［2-3］。胚胎的稳定着床、生长发育和胎盘的形成都与绒毛外滋养层细胞增殖迁移和浸润等过程密切相关［4］。可乐定（clonidine，CLO）是咪唑类衍生物，化学名为N-（2，6-二氯苯基）-4，5-二氢-1H-咪唑-2-胺，是一种α2-肾上腺素受体激动剂，临床上用于治疗高血压的一种中枢性降压药［5-6］，主要用于治疗中、高度高血压，与其他类降压药合用时具有协同作用［7］。有研究表明［8］，CLO可以促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的生成，调节胎盘血管内皮细胞与滋养层细胞之间的交联。VEGF可以上调基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）及其趋化因子受体（chemokine receptor-4，CXCR4）的表达［9-11］，SDF-1/CXCR4信号具有抗凋亡作用［12］，而CXCR4拮抗剂可以抑制SDF-1/CXCR4信号，抑制人胰腺癌细胞的迁移和入侵［13］。本研究在已有工作的基础上，以经典的HTR8-SVneo滋养细胞为研究对象，探讨CLO对滋养层细胞增殖和迁移的影响及可能的分子机制。

1 料与方法

1.1 实验材料与试剂

1.1.1 实验材料HTR8-SVneo细胞，购于中科；上海生命科学研究；细胞中心。

1.1.2 实验试剂CLO粉剂、AMD3100（CXCR4抑制剂，Sigma公司；DC101（VEGF受体抑制剂，英国Imclone公司）；胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）；RPMI-1640培养基（杭州四季青）；RT-PCR试剂盒、RTPCR引物（大连宝生物公司）；抗体（美国BIO SYSTEM公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组HTR8-SVneo细胞用RPMI-1640培养基（10%FBS）置于培养箱（37℃、5%CO2）中孵育，选用处于生长期的细胞进行实验。分组如下：①control组（Con），②CLO组（CLO作用浓度分别为0.1、1、10μmol/L），③CLO+DC101组（10μmol/LCLO，40μg/mLDC101），④CLO+AMD3100组（10μmol/LCLO，1μmol/L AMD3100），⑤CLO+DC101+AMD3100组（10μmol/LCLO，40μg/mLDC101，1μmol/LAMD3100）。1.2.2 MTT检测细胞增殖细胞接种于培养板（0.2×104个/孔），按照以上分组分别加入不同浓度的CLO和抑制剂DC101、AMD3100，培养48 h后加入MTT，再培养4 h后加入DMSO，震荡10min，酶标仪测定570 nm处的OD值。

1.2.3 Transwe l l检测细胞迁移Transwell板上室加入HTR8-SVneo单细胞悬液（1×105个/孔），再按照以上分组加入不同浓度的CLO和抑制剂DC101、AMD3100，下室加入RPMI-1640培养液（10%FBS），培养48 h后甲醇固定滤膜下表面的细胞，苏木精染色，高倍显微镜（200×）下计数。

1.2.4 RT-PCR检测VEGF、CXCR4 mRNA表达细胞接种于培养板（1×105个/孔），按照分组加入不同浓度的CLO和抑制剂DC101、AMD3100，培养48 h后收集细胞，Trizol提取细胞总RNA，加入引物逆转录合成cDNA，RNA反转录的反应条件：25℃5 min，42℃60 min，70℃5 min；SYBR-Premix Ex-TaqⅡ试剂盒及ABI7500 RT-PCR仪进行DNA扩增；产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描成像。RT-PCR引物具体见表1。

1.2.5 Wes tern b l ot检测VEGF、CXCR4蛋白表达细胞提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，总蛋白经SDS-PAGE电泳分离，转膜，封闭1 h，再分别加入相应的一抗稀释液（1：1000），4℃封闭过夜，洗膜后加入二抗（1：500）孵育1 h，显影成像。

表1 RT-PCR引物

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.5进行实验数据分析，电泳图像用Quanity One软件进行灰度分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用One-way ANOVA。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 果

2.1 CLO促进HTR 8-SVneo细胞增殖和迁移

不同浓度CLO（0.1～10μmol/L）作用于HTR8-SVneo细胞发现，和Con组比较，CLO显著促进细胞的增殖和迁移（P＜0.05），且呈剂量依赖关系。见图1。

图1 可乐定促进HTR8-SVneo细胞增殖和迁移

2.2 可乐定上调VEGF、SDF-1、CXCR 4的表达水平

与Con组比较，CLO促进滋养细胞VEGF、SDF-1和CXCR4mRNA和蛋白的表达，且随着浓度的增加而上调（P＜0.05）。见图2。由此可以推测，CLO对滋养细胞增殖、迁移的促进作用可能与上调VEGF、SDF-1、CXCR4的表达水平有关。

图2 可乐定促进HTR8-SVneo细胞VEGF、CXCR4表达水平

2.3 DC101/AMD3100抑制HTR 8-SVneo细胞增殖和迁移

CLO（10μmol/L）分别与抑制剂DC101或AMD3100作用于滋养细胞，与CLO组比较，抑制VEGF、CXCR4的表达，滋养细胞的增殖和迁移指数明显下降（P＜0.05）。见图3。由此可知，VEGF和CXCR4可以促进滋养细胞的增殖和迁移。

图3 DC101和AMD3100抑制HTR8-SVneo细胞的增殖和迁移

2.4 VEGF可调控SDF-1/CXCR 4信号

已知CXCR4是SDF-1特异受体，两者交联后可以产生信号通路，加入VEGF的抑制剂DC101后，SDF-1和CXCR4的表达水平显著下降（P＜0.05）（图4）。说明VEGF可以调节SDF-1/CXCR4信号的激活，进而发挥作用。

3 论

CLO可用于治疗妊娠高血压［5］，尤其与其它类降压药合用时具有协同作用，疗效更加显著［14］，但其作用机制还不十分清楚。我们前期的实验结果表明，CLO在0.1～10μmol/L浓度范围可显著促进HTR8-SVneo滋养细胞的增殖和迁移。VEGF是血管内皮生长因子，在妊娠过程中，VEGF及其受体主要在胎盘组织的滋养层细胞、血管内皮细胞中表达，可以促进滋养层细胞增殖、侵袭等［15-16］。趋化因子SDF-1在胚胎发育、血管生成等生理过程中发挥重要作用［17］，文献报道，CXCR4是目前已知的SDF-1特异受体［18］，两者交联后可以产生信号通路，参与人体很多生理活动，例如促进血管的生成［19-20］，作为淋巴细胞的共刺激分子参与免疫调节作用，参与妊娠期胚胎的着床过程［21］等。为了进一步探究可乐定的促滋养细胞增殖迁移的作用是否与VEGF和CXCR4有关，通过实验发现可乐定可以上调滋养细胞VEGF和SDF-1/CXCR4的表达，且具有剂量依赖性，进一步探究可知，分别抑制VEGF、CXCR4的表达，可乐定对滋养细胞增殖、迁移的促进作用被减弱，说明CLO促进滋养细胞增殖和迁移的作用机制与VEGF、SDF-1/CXCR4的表达有关，且VEGF可以正向调控SDF-1/CXCR4的激活，从而得出结论，CLO通过VEGF激活SDF-1/CXCR4信号，从而发挥促进滋养细胞增殖和迁移的作用。绒毛外滋养层细胞在妊娠期发挥着十分重要的作用［22］，滋养层细胞的正常增殖、迁移、浸润等，可以确保胎盘着床稳定，胎儿健康发育［23］，还可分泌各种分子，促进子宫内血管生成［24］。研究表明，娠高征患者胎盘着床浅，子宫螺旋小动脉障碍［25］，绒毛血管发生异常，这些病症与滋养层细胞的增殖、迁移、浸润至子宫肌壁间等密切相关［26-28］。本实验结果表明CLO可以促进滋养细胞的增殖和迁移，且通过VEGF激活SDF-1/CXCR4信号发挥作用，说明VEGF和SDF-1/CXCR4信号可以作为CLO治疗妊娠高血压的新靶咖，为临床研究提供依据。然而体内是一个极其复杂的环境，各种分子和信号通路相互交联相互作用，故具体的作用机制还有待进一步的深入研究。

图4 DC101抑制HTR8-SVneo细胞SDF-1和CXCR4的表达

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Clonidine promotes HTR8-SVneo cells proliferation and m igration ability via activating SDF-1/CXCR4 signal by VEGF

ZHANG Jin ZHAO Xinyuan ZHANG Jianhua
The Second Division of Obstetrics，Second Affiliated Hospital to Medical School of Xi'an Medical College，Shaanxi Province，Xi'an 710024，China

Ob jective To investigate the effects of Clonidine on proliferation and migration of HTR8-Svneo cells and exploremechanism.Methods MTT and Transwellmethodswere used to determine the proliferation andmigration abilities of HTR8-SVneo cells after incubated with Clonidine.Vascular endothelial growth factor（VEGF）and stromal cellderived factor-1（SDF-1），chemokine receptor-4（CXCR4）were evaluated by RT-PCR and Western blot.The proliferation and migration weremeasured after incubated with VEGFR inhibitor（DC101）or CXCR4 antagonist（AMD3100）.And CXCR4 expression level was evaluated after incubated with DC101.Results Clonidine can promote proliferation and migration of HTR8-SVneo cells（P＜0.05）.VEGF and CXCR4 expression level were notably up-regulated（P＜0.05）. DC101 and AMD3100 inhibit HTR8-SVneo cells proliferation，migration and DC101 suppressed CXCR4 expression（P＜0.05）.Conclusion Clonidine promotes proliferation and migration abilities of HTR8-SVneo cells by activating SDF-1/CXCR4 signaling via VEGF.

Clonidine；HTR8-SVneo cells；Proliferation；Migration；Vascular endothelial growth factor；Stromal cellderived factor-1/chemokine receptor-4

R714.25

A

1673-7210（2016）05（c）-0035-05

2016-02-17本文编辑：苏畅）