肝素结合表皮生长因子的高表达与稽留流产病因的相关性研究

罗树玲 郑春艳 曹锦慧

【摘要】目的：肝素结合表皮生长因子（HB-EGF）在女性生殖系统中有非常重要的作用，它能促进子宫内膜从增殖期向分泌期转化，并且介导受精卵着床，促进胎盘的形成和生长，同时也有抑制凋亡的作用。本研究意在探讨HB-EGF在稽留流产的病因中所起到的作用。方法：选取意外妊娠的患者12例作为对照组，稽留流产的患者13例为实验组，采用人流术或刮宫术取得子宫蜕膜组织和胎盘组织，利用免疫组织化学染色的方法检测实验组和对照组的蜕膜组织与胎盘组织里的HB-EGF的水平。结果：稽留流产患者的蜕膜组织与胎盘组织内的 HB-EGF表达均有上调[分别是（143.31±12.50）和（115.72±12.13）]，并且明显高于对照组的蜕膜组织与胎盘组织内的 HB-EGF表达[分别是（102.40±13.21）和（82.30±9.97）]。结论：研究数据表明HB-EGF的高表达在稽留流产中可能是导致死胎滞留腹中的原因。

【关键词】肝素结合表皮生长因子；稽留流产

【Abstract】Objectives： Heparin-binding epidermal growth factor（HB-EGF）has important biologic functions in the female reproductive tract. It helps to promote the uterine from proliferation stage to secretory stage， and has functions in implantation， placenta development， and also inhibition of apoptosis. This research aims to explore the possible role of HB –EGF in missed abortion. Methods： Decidual and placental tissue samples were obtained from 12 women with unwanted pregnancy as the control group and from 15 women with missed abortions as the experiment group. Immunohistochemistry was used to compare HB- EGF expression in uterine decidual tissue and in placental villous stroma of the two groups. Results： HB-EGF expression in both uterine decidual tissue and placental villous stroma was up-regulated in the missed abortion group （143.31±12.50 and 115.72±12.13 respectively）， compared with the control group （102.40±13.21 and 82.30±9.97102.4， respectively）. Conclusion： The up-regulated expression of HB-EGF may inhibit the discharge of dead fetus in missed abortions.

【Key words】Heparin-binding epidermal growth factor； Missed abortions

【中图分类号】R169.42【文献标志码】A

稽留流产又名过期流产，指宫内胚胎或胎儿死亡后未及时排出者，它属于一种特殊的自然流产[1]。近年来，稽留流产的发病率逐年增加[2]。造成稽留流产的原因较多，如染色体的数量或结构等异常、子宫畸形、严重营养缺乏、环境不良因素及精神因素等[3]。前人在稽留流产的诊断及治疗方面做了很多相关性研究，但对于稽留流产的病因研究却较少，因此本文旨在对稽留流产的病因做一探讨。

作为表皮结合因子（EGF）家族的一员，肝素结合表皮生长因子（HB-EGF）基因是位于人类第5号染色体长臂上，分子质量为20～22ku， 由208个氨基酸构成[4]。HB-EGF可由巨噬细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞等分泌产生，其产物可在多种组织和器官（包括女性生殖系统）中广泛表达，参与多种生物学活动，如胚泡着床、促进胎盘的形成和生长，同时也有抑制凋亡的作用[5]。HB-EGF是一种跨膜蛋白，由跨膜片段（proHB -EGF）和分泌片段（sHB -EGF）组成，其中sHB-EGF可与受体结合。HB-EGF有两种受体，分别是HER/ErbB受体和硫酸乙酰肝素蛋白多糖 （HSPG），HB-EGF可在HSPG的辅助下激动HER1和HER4受体，而对HER2受体和HER3受体无激动作用[6]。

研究表明，HB-EGF在多种生理及病理过程中都发挥着作用，例如介导细胞黏附、趋化、细胞有丝分裂、抑制细胞凋亡等。它可以通过激动HER1和HER4受体介导细胞黏附，而通过HER3受体信号介导趋化和促进细胞有丝分裂[7]。

HB-EGF与女性的生殖内分泌功能有着密不可分的关系。作为可介导胚泡着床的4种必需因子之一，其在众多过程中都起着重要的作用，比如促进人类子宫内膜的生长和分化、促进胎盘的生长和发育以及会介导胚泡的粘附、着床和植入子宫内膜等[8]。Birdsall等[9]研究证明在女性月经周期中的子宫内膜间质细胞和上皮细胞存在HB-EGF mRNA，且检测了HB-EGF蛋白的表达量与子宫内膜随着卵巢甾体激素的变化同步。 Chobotova等[10]研究发现HB-EGF可通过EGF受体和 ErbB4 介导人类的子宫内膜蜕膜化。HB-EGF在孕早期的绒毛膜绒毛、孕中期的绒毛以及足月胎盘中都是有明显表达的[11]。在体外培养滋养细胞时，HB-EGF能维持滋养细胞的存活，抑制其凋亡[12]。

HB-EGF在促进子宫内膜的功能、促进受精卵着床、胎盘的形成与发育、维持妊娠等方面的作用都得到了大量的证实，但它在稽留流产病因中的研究报道极少，故本研究将对HB-EGF与稽留流产中引起死胎滞留原因的相关性做一探讨。

1材料与方法

1.1标本来源

从我院2014年3月至2015年1月就诊的病人里选取27例为研究对象，其中意外妊娠（孕5～10周）的患者12例作为对照组，稽留流产（孕6～12周）的患者13例为实验组。对照组的平均年龄为26.12岁（22～33岁），实验组的平均年龄为27.27岁（21～35岁）。通过经阴道超声诊断为流产，在获得所有实验对象的知情同意以后，在经腹超声的监视下行人流术或刮宫术获取子宫内膜组织与胎盘组织。

1.2染色与制片

首先清洗子宫内膜组织与胎盘组织，用10%甲醛固定，不同梯度的酒精脱水处理，接着石蜡包埋，连续切片，片厚4～5μm，将切片脱蜡处理并置水中漂洗；利用微波高档将抗原修复液（250 mL蒸馏水中含5.25 g柠檬酸和7.35 g柠檬酸钠） 加温3 min，待其温度升至约96℃，切片放入修复液中，低温处理10 min以保温，取出后冷却至室温；3%H2O2消除内源性过氧化物酶，用1%牛血清蛋白封闭其他无关的抗原，滴加一抗（山羊抗人HB-EGF多克隆抗体），室温孵育2h，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，加入适量的生物素化二抗，在37℃孵育20 min，加入适量的辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，37℃孵育20 min；用二氨基联苯胺（DAB）显色5～10min，苏木素染核，后封片观察。标本均设阴性和阳性对照，阴性对照用PBS代替一抗进行染色。

1.3判定标准

免疫组化的着色强度评定参照H 指数[13]，以胞浆内出现浅黄色至棕黄色反应者为阳性，着色强度高于背景非特异染色，无显色或显色不明显者为阴性，其得分分别有0分（未染色），1分（着色弱，可分辨），2分（中度染色），3分（强染色）。对每一份标本均进行H得分评估，最后的计算公式为：

H得分=∑Pi（i+1）

其中i为着色强度，分别用0（未染色），1（着色弱，可分辨），2（中度染色），3（强染色）赋值，Pi为相应染色强度的部分所占的百分比，取值范围为0%到100% 。分别随机选取5个中倍镜视野下观察。H得分评估采用双盲的方式，最少要两个观察者分别完成。见表1。

1.4数据处理

所有数据均在SPSS19.0软件上分析。两组间通过t检验去比较，P<0.01时视为有显著差异。见表2。

2结果

2.1免疫组化染色的结果

两组的染色结果显示均有HB-EGF阳性细胞的表达，稽留流产患者的蜕膜组织与胎盘组织内HB-EGF的染色强度（见图1中的c、d）明显强于正常妊娠组（见图1中的a、b），从染色结果可定性判断稽留流产中HB-EGF的表达是上调的。

2.2数据分析的结果

通过统计分析，稽留流产患者的蜕膜组织与胎盘组织内的 HB-EGF表达上调[分别是（143.31±12.50）和（115.72±12.13）]，并且明显高于对照组[分别是（102.40±13.21）和（82.30±9.97）]。该结果有统计学意义。统计结果见表1，误差线分析见图2。

3讨论

本论文探究了HB-EGF在正常妊娠和稽留流产的子宫蜕膜组织和胎盘组织中的表达，主要通过免疫组化染色的方法进行，结果表明在稽留流产中HB-EGF的表达是上调的，并且所得结果具有统计学意义，因而我们可以推测在稽留流产中HB-EGF的高表达可能是导致死胎滞留腹中的原因。

近些年来，HB-EGF在生殖内分泌的研究领域吸引了极大的关注，在子宫内膜、卵巢黄体、输卵管、胎盘、绒毛蜕膜和胚泡中被实存在HB-EGF及其受体，并通过自分泌和旁分泌的方式与受体结合进而发挥了重要的生物学作用。

之前的研究证实HB-EGF可促进子宫内膜的蜕膜化[14]，它还可以同时作为黏附因子和生长因子促进受精卵着床，并且在胎盘的形成与发育[10]、维持妊娠等方面也都有着重要作用。HB-EGF在胚胎植入过程中发挥多重作用：（1）通过蛋白水解的方式裂解为胚胎发育的诱导物，进而促进胚胎发育；（2）作为胞饮突表面的跨膜因子可以与滋养外胚层细胞上HB-EGF的特异受体结合，进而介导胚胎和子宫内膜之间的黏附；（3）胚胎侵入子宫后受到其辅助修复其中的内膜上皮。HB-EGF可以促进滋养细胞的迁移、侵袭，提高胚胎的存活率[14]。进一步研究发现HB-EGF可以通过基质金属蛋白酶2、9和金属蛋白酶抑制物1、2的表达影响滋养细胞的侵袭能力[14]。Gonzalez等[15]发现蜕膜细胞是胚胎质量和决定HB-EGF和IL-1β等关键因素反映的选择性响应之间的的生物传感器。HB-EGF在细胞滋养、细胞发育和分化等过程中起到了重要的促进作用；Lala等[16]的研究表明，HB-EGF可以调节并滋养细胞的侵袭和迁移。HB-EGF表达量下降，滋养细胞则会出现迁移侵袭力的缺乏，从而造成了胎盘的病理变化，导致子痫前期和胎儿损伤。在人体正常、炎症、妊娠输卵管壶腹部黏膜上皮细胞均有HB-EGF的表达，较正常组来说，炎症组和妊娠组其均有增强，且差异具有统计学的意义。

HB-EGF的低表达与某些妊娠并发症的发生有关，如子痫前期和早期流产。我们的研究通过免疫组化染色的方法证明了HB-EGF在稽留流产的子宫蜕膜组织和胎盘组织中的表达是上调的，明显高于正常妊娠组。

HB-EGF作为子宫蜕膜化因子、滋养细胞侵袭调节因子以及潜在的保护者，对于正常妊娠的维持必不可少。在稽留流产中该因子的高表达是否就是死胎滞留腹中的原因，以及它是如何调控这一过程的，还有待进一步研究与印证。

参考文献

[1]陈发弟. 米非司酮配伍米索前列醇治疗稽留流产的疗效观察. 中国计划生育学杂志， 21（11），751-753.

[2]Chen BA，Creinin MD.Contemporary management of early pregnancy failure.Clin Obstet Gynecol，2007 ，50（1）：67-88.

[3]Zhang X， Li J， Gu Y， et al. A pilot study on environmental and behavioral factors related to missed abortion. Environ Health Prev Med， 2011，16（4）：273-278.

[4]汤小晗，卢美松.肝素结合表皮生长因子在卵巢癌中的研究进展. 国际妇产科学杂志，2012，39（3）：250-253.

[5]Quaranta M， Erez O， Mastrolia SA， et al. The physiologic and therapeutic role of heparin in implantation and placentation. PeerJ， 2015，3：e691.

[6]Kemal Ozbilgin， Fatma Karaca， Afsin Turan，et al. The higher heparin-binding epidermal growth factor （HB -EGF） in missed abortion. Taiwanese Journal of Obstetrics & Gynecology， 2015， 54（1）： 13-18.

[7]Vinante F， Rigo A . Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor/diphtheria toxin receptor in normal and neoplastic hematopoiesis. Toxins （Basel）， 2013，5（6）：1180-1201.

[8]Robertson SA， Chin PY， Schjenken JE， et al. Female tract cytokines and developmental programming in embryos. Adv Exp Med Biol， 2015（843）：173-213.

[9]Birdsall MA， Hopkisson JF， Grant KE，et al. Expression of heparin-binding epidermal growth factor messenger RNA in the human endometrium. Mol Hum Reprod， 1996（2）：31-34.

[10]Chobotova K， Karpovich N， Carver J， et al. Heparin-binding epidermal growth factor and its receptors mediate decidualization and potentiate survival of human endometrial stromal cells. J Clin Endocrinol Metab，2005（90）：913-919.

[11]Imudia AN， Kilburn BA， Petkova A， 2015， 54（1）： 13-18.Expression of heparin-binding EGF-like growth factor in term chorionic villous explants and its role in trophoblast survival. Placenta， 2008（29）：784 -789 .

[12]Stavreus Eversa， Aghajanval， Brismarh. Coexistence of HB-EGF and pinopodes in human endometrium at the time of implantation. J Mol Hum Reprod， 2012 ， 8（8）：765-769.

[13]Fock V， Plessl K， Fuchs R， et al. Trophoblast subtype-specific EGFR/ERBB4 expression correlates with cell cycle progression and hyperplasia in complete hydatidiform moles. Hum-Reprod， 2015，30（4）：789-799.

[14]Di Simone N， Di Nicuolo F， Castellani R， et al.Low-molecular-weight heparins induce decidual heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor expression and promote survival of decidual cells undergoing apoptosis Fertility and Sterility， 2012， 97（1）： 169-177. e1.

[15]Gonzalez M， Neufeld J， Reimann K， et al. Expansion of human trophoblastic spheroids is promoted by decidualized endometrial stromal cells and enhanced by heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor and interleukin-1 b. Mol Hum Reprod， 2011（17）：421-433.

[16]Lala PK，Chakraborty C.Factors regulating trophoblast migration and invasiveness：possible derangements contributing to preeclampsia and fetal injury.Placenta，2003（24）：575-587.

（收稿日期：2015-07-29）