嗜酸性氧化亚铁硫杆菌低温诱变试验研究

袁檬，翁沁玉，卢进登

(湖北大学资源环境学院，湖北 武汉，430062)



嗜酸性氧化亚铁硫杆菌低温诱变试验研究

袁檬，翁沁玉，卢进登

(湖北大学资源环境学院，湖北 武汉，430062)

嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans，简称A.ferrooxidans菌)在生产实践中有着广泛的运用和发展前景，然而低温是限制其发展的一个重要因素.通过紫外线低温诱变试验探讨A.ferrooxidans菌低温诱变的可行性.结果表明：1)Fe2+浓度随时间变化的曲线呈反“S”型，A.ferrooxidans菌的活性变化符合“S”型增长曲线；2)紫外线诱变可以产生适宜低温生长的A.ferrooxidans菌种，但诱变时间30 s、60 s的效果无显著差异；3)A.ferrooxidans菌的活性是随温度的降低而减小的，诱变产生的菌种并不能逆转这一生长规律；4)3个诱变温度相比较，15 ℃的诱变效果最佳，诱变组的Fe2+氧化率比未诱变的空白组高了14%，这也表明了A.ferrooxidans菌紫外线低温诱变的可行性，为A.ferrooxidans菌的推广和应用提供一定的理论支持.

A.ferrooxidans菌；紫外线诱变；邻啡罗啉比色法

0 引言

嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans，简称A.ferrooxidans菌)是一种化能自养且专性好氧的嗜酸革兰氏阴性菌，以自身细胞分裂的形式进行繁殖，可以固定空气中的CO2，以氧化Fe2+、S0及S2-的化合物等来获得生长过程所需的能量[1-2].A.ferrooxidans菌在生产实践中主要运用在3个方面：1)生物冶金.A.ferrooxidans菌是迄今已报道的20多种浸矿细菌中研究得最多的浸矿细菌，主要应用在铀矿和低品位铜矿的堆浸上[3-4]，后来发展出利用细菌氧化作用处理难处理的金属矿的方面，可处理铀、锑、福、钻、铝、镍和锌等多种硫化金属矿，种类多达19种.2)金属及矿物材料的微加工.A.ferrooxidans菌可生物合成黄钾铁矾(一种环境友好材料)、施氏矿物等金属、矿物材料.周顺桂等[5]利用A.ferrooxidans菌的生物催化氧化作用在常温常压条件下合成赭黄色的黄钾铁矾，经鉴定其晶体粒径均匀，分散性好，且没有无定形的羟基硫酸高铁副产物.张德远[6]等人利用A.ferrooxidans菌成功开展了纯铜的生物加工实验，明确了生物加工过程中细菌对铁离子循环的动力学作用，给出了生物加工系统离子循环模型.3)环境工程应用.目前A.ferrooxidans菌在矿山废水废渣处理、煤炭和燃油脱硫、去除H2S以及生活和工业废水中的重金属离子、清除放射性水泥等方面都已经得到了运用，该类技术具有经济、高效、低污染等优点，运用的前景十分广泛.

A.ferrooxidans菌用途广泛且发展前景大，然而冬季的低温是其发展所要面临的一个难题.低温条件下A.ferrooxidans菌生长缓慢，活性大大降低，无法继续工作.因此本研究中设计A.ferrooxidans菌紫外线低温诱变(紫外线可引起诸如DNA链的断裂、DNA分子内和分子间的交联、核酸与蛋白质的交联、胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用以及胸腺嘧啶二聚体的形成等多种变化[7]，从而引起碱基转换、颠倒、移码突变或缺失，达到诱变的目的)的试验方案，定期监测细菌培养期间培养基的pH值、Fe2+和Fe3+的浓度的变化情况，并将诱变组与未经过诱变的空白组进行对比分析，观察各培养期间细菌的生长特征，氧化Fe2+和水解Fe3+的效率，进而论证A.ferrooxidans菌紫外线低温诱变的可行性，找出合适的紫外诱变温度、时间，培养出可以适应冬季低温条件的菌种，以及为A.ferrooxidans菌的推广和广泛应用提供理论支持.

1 材料与方法

1.3 测定方法 亚铁(Fe2+)：邻啡罗啉比色法(GB7873-87，3)[8].分别吸取铁的标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于6支50 mL比色管中，对管口、内壁吹水，将附着于内壁的水样冲到管底，然后依次分别加入5 mL醋酸-醋酸铵缓冲溶液，摇匀，加入0.5%邻菲罗啉溶液2 mL，摇匀，加水至刻度，静置15 min，在510 nm波长处，用1 cm比色皿，以空白为参比，测定溶液吸光度，以吸光度为纵坐标，亚铁含量为横坐标，绘制出标准曲线.

先向比色管中各滴加2滴1:1浓硫酸(防止Fe2+被A.ferrooxidans菌氧化)，再吸取待测水样20 μL于50 mL比色管中，按照绘制标准曲线的操作，测得水样吸光度，由标准曲线查得相应亚铁含量，计算出亚铁的摩尔浓度.

总铁(TFe)：吹水后先加入10%盐酸羟胺1 mL(还原样品中的Fe3+)，其余步骤与亚铁测定方法相同，计算出待测溶液中总铁的摩尔浓度.

1.4 菌种与培养基 菌种：A.ferrooxidans菌浓缩菌液放入28 ℃的SPX-150B-D型振荡培养箱中培养活化并定时传代保持活性.

培养基：本试验所用培养基为9K液体培养基，其组成为：44.48 g的FeSO4·7H2O，0.01 g的Ca(NO3)2·4H2O，0.5 g的MgSO4·7H2O，0.1 g的KCl,0.5 g的K2HPO4，3 g的(NH4)2SO4，去离子水1 L，用1∶1硫酸调节pH到2.5.

2 结果与分析

2.1A.ferrooxidans菌在15 ℃下紫外线诱变结果分析 实验测得20、15、10 ℃下紫外线诱变后培养基的pH值和亚铁、总铁含量变化情况.现以15 ℃为例分析诱变后A.ferrooxidans菌各培养阶段的活性状态.3个阶段测得的pH值如表1，亚铁、总铁的摩尔含量变化情况依次如表2、表3，pH值、亚铁及总铁均测定初始值.

表1 15 ℃的3个培养阶段的pH值

表2 15 ℃的3个培养阶段的Fe2+的摩尔浓度值 mmol/L

表3 15 ℃的3个培养阶段的TFe的摩尔浓度值 mmol/L

表4 15 ℃的3个培养阶段的Fe2+的氧化速率 mmol/L·d

表5 15 ℃的3个培养阶段的Fe2+的氧化率

表6 15 ℃的3个培养阶段的总铁沉淀率

表5中第一培养阶段两组诱变菌种将亚铁氧化完全用了4 d，而第二、三阶段却只花了3 d，对照组3个阶段的第3天均氧化了85%的亚铁，这是因为照射紫外线后有部分细菌死亡，培养基中产生各种类型的菌种互相争夺养料，其中适宜15 ℃生长的菌种在第一阶段过程中不断排挤其他菌群，最终占据优势地位，此时细菌数量达到最大.又第二、三阶段各组的亚铁氧化率变化是大致相同的，这表明此时A.ferrooxidans菌的生长已稳定.因此之后的数据对比均取第三阶段的数据.

A.ferrooxidans菌将Fe2+全部氧化需3 d，与国内去除酸性废水中铁离子的常规方法相比，耗时较长，但更加安全、清洁，且便于操作和管理.而如曝气法，次氯酸钠氧化法等常规方法，虽然除铁效果明显，用时短，却存在劳动卫生环境差，资源浪费，处理费用高，腐蚀性强，无法实现资源化利用的缺点.

第二、三阶段的第3天，总铁沉淀率并无显著差异，这是因为Fe3+水解后生成黄钾铁矾类矿物沉淀的反应尚在初期，仅有少量沉淀生成，各组间的差别不大.而此时诱变的两组之间亚铁的氧化率无明显差异，又都比空白组高，高了14%，其氧化速率亦高于空白组，这说明诱变是有效果的，但30 s和60 s两种诱变时间的效果无显著差别.

2.2A.ferrooxidans菌在20 ℃、15 ℃与10 ℃下紫外线诱变结果对比分析 培养过程中第二、三阶段为稳定时期，故取20 ℃、15 ℃与10 ℃下诱变后第三培养阶段的Fe2+氧化率做表7.3个诱变温度下A.ferrooxidans菌将亚铁氧化完全依次需要2 d、3 d和5 d，10 ℃花时最长，是20 ℃的2.5倍，15 ℃的1.67倍，Fe2+氧化速率随温度的降低而减小的，这说明A.ferrooxidans菌的活性是随温度的降低而减小的，这一现象是符合细菌生长特征的.实验中的A.ferrooxidans菌属于嗜温菌，最佳生长温度是28 ℃.小于28 ℃时其活性降低，温度回升，活性恢复，温度高于28 ℃时其活性发生不可逆转的降低.实验产生的诱变菌种并不能逆转这种生长规律.

3个温度相比较，15 ℃时诱变组与空白组的Fe2+氧化率的差距是最大的，诱变30 s组的Fe2+氧化率比空白组高了14%，即15 ℃的诱变效果最佳.有另一种细菌——氧化铁鞘细菌——可以产生一种胞外酶来氧化水中的Fe2+，但该酶的最适温度为30 ℃，最适pH为7.0，pH过高或过低都会对该酶的酶活产生较大影响.与A.ferrooxidans菌相比，既不符合冬季的低温条件，也不能适应酸性废水.

表7 20 ℃、15 ℃和10 ℃的Fe2+的氧化率

2.3 小结 综上所述，A.ferrooxidans菌的活性变化是符合有限环境容量下微生物的“S”型增长曲线的.紫外线诱变可以产生适宜低温生长的A.ferrooxidans菌种，但诱变时间30 s、60 s的效果无显著差异.20 ℃、15 ℃与10 ℃时诱变效果相比较，15 ℃的诱变效果最佳，诱变组的Fe2+氧化率比未诱变的空白组高了14%.

3 结论与讨论

本研究可得出如下结论：1) Fe2+浓度随时间变化的曲线呈反“S”型，Fe2+浓度又与A.ferrooxidans菌的活性成反比，因而A.ferrooxidans菌的活性变化是符合有限环境容量下微生物的增长曲线——“S”型增长曲线的；2) 各组亚铁氧化率在第二、三培养阶段的变化大致相同，这表明此时A.ferrooxidans菌的生长已稳定，故取第三培养阶段的数据作为有效数据；3) 紫外线诱变可以产生适宜低温生长的A.ferrooxidans菌种，但诱变时间30 s、60 s的效果无显著差异；4)A.ferrooxidans菌的活性是随温度的降低而减小的，诱变产生的菌种并不能逆转这一生长规律；5) 3个诱变温度相比较，15 ℃的诱变效果最佳，诱变组的Fe2+氧化率比未诱变的空白组高了14%.

研究可能存在的问题及对后续研究的展望：a) 未直接测定A.ferrooxidans菌的活性，而是通过Fe2+的含量变化间接表示；b) 就不同诱变时间、次数、温度对A.ferrooxidans菌的活性进行更详细、深入的研究，可得到更全面的数据支持，有利于建立A.ferrooxidans菌活性与诱变时间和温度的关系的数学模型.

[1] Kelly D P，Wood A P. Reclassification of some species ofThiobacillusto the newly designated generaAcidithiobacillusgen. nov.，Halothiobacillusgen. nov. andThermithiobacillusgen. nov.[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2000，50: 489-500.

[2] Temple K L，Colmer A R. The autotrophic oxidation of iron by a new bacteriumThiobacillusferrooxidans[J]. Journal of Bacteriolgy，1951，61: 605-611.

[3] Abhilash K D Mehta，Bansi D Pandey. Efficacy of bacterial adaptation on copper biodissolution from a low grade chalcopyrite ore byA.ferrooxidans[J]. International Journal of Nonferrous Metallurgy，2012，1(1): 1-7.

[4] 徐晓军，孟运生，宫磊，等.氧化亚铁硫杆菌紫外线诱变及对低品位黄铜矿的浸出[J]. 矿冶工程，2005，25(1): 34-36.

[5] 周顺桂，周立祥，黄焕忠.黄钾铁矾的生物合成与鉴定[J]. 光谱学与光谱分析，2004，24(9): 1140-1143.

[6] 张德远，李雅芹，吴依陶.生物加工纯铜的动力学与热力学研究[M]. 中国科学(C辑)，1999，29: 132-137.

[7] 徐晓军，孟运生，宫磊，等.氧化亚铁硫杆菌紫外线诱变及对低品位黄铜矿的浸出[J]. 矿冶工程，2005，25(1): 34-36.

[8] 鲍士旦.土壤农化分析[M]. 3版.北京：中国农业出版社，1981: 225-226.

(责任编辑 游俊)

Experimental study on ultraviolet mutation of Acidithiobacillus ferrooxidans at low temperature

YUAN Meng，WENG Qinyu，LU Jindeng

(Faculty of Resources and Environmental Science，Hubei University，Wuhan 430062，China)

Acidithiobacillusferrooxidansis widely used in production practice and has development prospect，but low temperature severely limits its developing. Through the ultraviolet mutation experiment ofA.ferrooxidansat low temperature，the feasibility of this method was discussed. Experimental results showed that the ferrous molarity changed as a reversed S shape over time. A newA.ferrooxidanswhich is suitable for grow in low temperature could be generated by ultraviolet mutation，although the effects of two different mutagenesis times(30 s、60 s) had no significant difference. And theA.ferrooxidansactivities were decreased as the temperature decreased. Furthermore，the comparison of three different mutagenesis temperature showed that the mutagenic effect was the best at 15 ℃. The above conclusions indicate that the ultraviolet mutation method is feasible. And it provide some theoretical support for the popularization and application ofA.ferrooxidans.

Acidithiobacillusferrooxidans；ultraviolet mutation；phenanthroline colorimetry

2015-10-19

科技部科技惠民计划(S2013GMD100042)和湖北省科技支撑计划(2015BCA294)资助

袁檬(1992-)，女，硕士生；卢进登，通信作者，教授，E-mail：ljd@hubu.edu.cn

1000-2375(2016)06-0557-04

Q93-3

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2016.06.015