肠炎清对ICUC大鼠结肠组织TLR4、NF—κB蛋白表达、TLR4mRNA的影响

黄亦彤+钟志勇+吕永慧+蓝天美+潘竞锵+武昕

摘要：目的通过观察肠炎清对免疫复合溃疡型结肠炎模型（ICUC）大鼠结肠组织Toll样受体4（TLR 4）和核因子-κB（NF-κB）表达的影响，探讨肠炎清治疗IBD的作用机制。方法采用三硝基苯磺酸（TNBS）加免疫复合法造模。将大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、肠炎清低、中、高剂量组（833、1667、3333mL/kg）、柳氮磺吡啶（SASP）组（05g/kg）。造模后第2 d，用药组分别给予相应药物灌胃7d，给药7天后麻醉处死大鼠，取新鲜结肠标本，采用免疫组化法检测TLR 4、NF-κBp65的表达，实时定量PCR法（qRT-PCR）检测TLR 4mRNA的表达。结果免疫组化结果：NF-κBp65和TLR4在各组各只动物均可见阳性表达，其中肠炎清高剂量组及SASP组可显著下调NF-κBp65的表达，有统计学差异（P<005）。TLR4在各给药组与模型组比较未见显著差异（P>005）。PCR结果：与模型对照组相比，各给药组大鼠结肠组织TLR4表达均为阳性，但未见统计学差异（P>005）。结论下调TLR4、NF-κBp65的表达，是肠炎清治疗IBD的作用机制之一。

关键词：肠炎清；溃疡性结肠炎；ICUC大鼠；TLR4；NF-κBp65

中图分类号：R2855文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）09-0072-04

【Abstract】Objective： To observe the effect of Changyanqing on the colon tissue Toll-like receptor 4 （TLR 4） and nuclear factorκB （NF-κB） expression of immune complexes ulcerative colitis （ICUC） rats and explore its mechanism to treat IBD. Methods： Trinitrobenzene sulfonic acid （TNBS） plus immune complex was used to make models. Rats were randomly divided into a control group， a model control group， Changyanqing groups with low， medium and high dose （833， 1667， 3333mL/kg） and sulfasalazine （SASP） group （0.5g/kg）. In the following the day after modeling， the treatment groups were administered with corresponding drugs for 7 days， and the rats were sacrificed 7 days later to take their fresh colonic samples. Immunohistochemistry was used to detect TLR 4 and NF-κBp65 expression， and RT-PCR method to detect TLR 4mRNA expression. Results： Immunohistochemical results： NF-κBp65 and TLR4 in each group can be seen positive expression， among which the expression of NF-κBp65 of Changyanqing group with high dose and SASP group could be significantly down-regulated， and there are significant differences （P<005）. TLR4 in each treatment group and the model group showed no significant difference （P>005）. PCR Results， compared with the model group， TLR4 expressions of the colon tissue of each administration group were positive， but there was no significant difference （P>005）. Conclusion： Changyanqing can down-regulate TLR4， NF-κBp65 expression， and its mechanism may be related to the regulation of TLR4 / NF-κB signal pathway.

【Key words】Changyanqing， ulcerative colitis， ICUC rats， TLR4， NF-κBp65

属非特异性的自发免疫性疾病，病变主要累及结肠黏膜和黏膜下层，临床主要表现为反复腹痛、腹泻、黏液血便等。其病因和发病机理至今仍不清楚，既往研究认为，细胞因子网络的失衡在IBD的发生发展中占有极其重要的地位。近年来不少研究发现，炎症介质及细胞因子可导致机体多条信号通路活化，直接或间接地影响炎症介质的表达，导致肠黏膜受损产生。

肠炎清是由我院自行研制的纯中药制剂，临床用于口服和灌肠治疗IBD、慢性腹泻、结肠息肉电切术后致肠黏膜受损、肠道菌群失调及肠功能障碍等。该药主治以湿热内蕴型为多见的肠炎，或兼有脾胃虚弱、气滞血淤，对受损肠黏膜有显著的治疗作用。肠炎清[1]经结肠途径治疗，对UC尤其是轻到中度UC 能够显著缩短疗程，减少或避免使用激素及SASP，减轻病人的痛苦。肠炎清在动物炎症模型中表现出良好的抗炎效应[2-3]。

本研究采用免疫复合溃疡型结肠炎（ICUC）大鼠模型，通过观察肠炎清对ICUC大鼠TLR4、NF-κBp65表达的影响，探讨肠炎清的作用机制。

1材料与方法

11材料

111实验药物肠炎清：广州市中医医院自制，2～8℃保存，批号：151128。柳氮磺吡啶肠溶片：上海信谊天平药业有限公司，批号：09141109生产日期：20141024；有效期至：201610。

112动物SD大鼠48只，雌性180～200g；SPF级；新西兰兔，雄性3kg左右；普通级，由广东省医学实验动物中心提供。大鼠实验动物质量合格证明编号44007200024500，兔实验动物质量合格证明编号44411600001758、44411600001799。

113试剂石蜡：茂名市大川特种蜡厂有限公司。环保透明剂：上海宏兹实业有限公司。无水乙醇、95%乙醇、曙红（水溶）：广州中南化学试剂有限公司。苏木素：GEMADA，Biological Stain Commission，Inc。PBS缓冲液：pH72～76、枸橼酸盐缓冲液：pH60，武汉博士德生物工程有限公司。

NF-κB p65 抗体：Arigo Biolaboratories集团公司，TLR4 抗体：罗福斯生物制剂公司，GTVisionTM Ⅲ检测系统/Mo&Rb：基因技术（上海）公司，正常山羊血清：Jackson ImmunoResearch实验公司，定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix购自Invitrogen公司，

114仪器TS-12C型生物组织全自动脱水机：湖北孝感医用仪器有限公司。EG1150型生物组织包埋机：LEICA，德国。RM2235型轮转切片机：LEICA，德国。CS-VI型摊片烤片机：湖北孝感医用仪器有限公司。BX43型生物显微镜：OLYMPUS，日本。定量PCR仪：ABI PRISM 7500 Sequence Detection System。

CellSens Standard显微图像软件：OLYMPUS，日本。Image-Pro Plus version 60图像分析软件：Image-Pro 美国。

12方法

121模型建立健康SD大鼠适应性饲养一周后建模，造模前禁食24h。：取50g/L TNBS溶液与50%乙醇溶液以体积比1∶1混合配成25g/L三硝基苯磺酸（TNBS）乙醇溶液；刮取新西兰兔结肠黏膜制成组织匀浆，以3000r/min速度离心30min，取上清液，检测其蛋白含量并调节至20g/L，与等量完全弗氏佐剂混合配成抗原乳化液，-20℃保存备用。

动物免疫：模型组大鼠全部于第1天、第14天在大鼠颈、背部注射抗原乳化液（体积为08mL/只动物，含抗原8mg）。第21天，所有大鼠禁食不禁水24h，第22天，各组大鼠TNBS乙醇溶液灌肠造模。

造模方法：大鼠戊巴比妥钠麻醉，将一直径20 mm、长约12 cm的塑胶管由肛门轻缓插入大鼠体内深约8cm，按照TNBS 75mg/kg的剂量，03mL/100g体重的给药体积缓慢注入25g/LTNBS乙醇溶液，然后注入约01mL的空气，将留在塑胶管内的药物排入肠内。给药完毕，缓慢拔出塑胶管，用手捏住肛门，提起大鼠尾部，持续倒置1min，使造模剂充分渗入大鼠肠腔内。空白对照组注入等量的生理盐水。验证模型：造模后第2天随机选取4只模型组大鼠麻醉后放血处死，剖腹取直肠和结肠，生理盐水清洗后肉眼观察结肠充血水肿情况，验证模型。

122动物分组及给药选取40只成模大鼠，随机分为5组。造模后第3天各组开始灌胃给药：肠炎清低、中、高剂量组按照833、1667、3333mL/kg（按照人临床用量的5、10、20倍折算）；SASP组按05g/kg；给药体积17mL/100g体重，2次/d，连续7天；空白对照组和模型对照组给予等体积的生理盐水。

123标本处理末次给药后24h，戊巴比妥钠麻醉、放血处死大鼠，开腹，取自肛门向上约10cm结肠段，沿肠系膜纵轴剪开，生理盐水冲洗，取一半用4%中性甲醛固定，用于组织病理和免疫组化检查，另一半液氮速冻，用于PCR检测。

124观察指标及检测方法

1241免疫组化法检测TLR4和NF-κBp65表达组织标本经取材、固定、修切、流水冲洗、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、石蜡切片（防脱）、脱蜡至水、抗原修复（微波法）、封闭内源性过氧化物酶、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、苏木素复染、脱水透明、封片。

每张切片放大400倍随机选取3个视野观察，细胞呈棕黄色为阳性，定位以细胞核为主。用图像分析软件分别测定各个视野的平均光密度值，取均值作为每张切片的平均光密度值。

1242qRT-PCR法检测TLR4mRNA表达[4]Trizol 法提取结肠组织RNA进行qRT-PCR扩增。样品1μl，1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整可证明RNA抽提比较完整。

逆转录：RNase free的PCR管中配置溶液Total RNA10μg+H2O总体积12μl，将溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性；在该PCR管中加入下列试剂Oligo（dT）15 05μl、Random primer（6-mer）05μl、二者浓度都是10uM、dNTP20μl、RNase inhibitor 05μl、5 x buffer 40μl、M-MLV 05μl总体积80μl。将上述20μl反应溶液30℃保温10min；42℃保温60min；85℃保温10min。

定量PCR：检测序列片段。内参片段：GAPDH-200bp，目的片段：TLR4-386bp

引物序列见表1。

并列表说明，各组数据以均数加减标准差表示（x±s），采用SPSS210统计软件，计量资料数据若方差齐，则采用单因素方差分析，组间比较用LSD法，若方差不齐，数据经转换后方差仍不齐，采用秩和检验进行统计分析。

2结果）PCR表达结果（x±s，n=8）：空白对照组：（274±164）；模型对照组：（311±199）；肠炎清低剂量组：（249±156）；肠炎清中剂量组：（318±185）；肠炎清高剂量组：（359±173）；SASP组：（362±236）。

与空白对照组相比，模型对照组大鼠结肠组织TLR4的表达有所增加，但未见统计学差异（P>005）。与模型对照组相比，各给药组大鼠结肠组织TLR4的表达均有不同程度的降低，但未见统计学差异（P>005）。

3小结

免疫组化法结果显示：NF-κB和TLR4在各组各只动物均可见阳性表达，具体情况如下：

NF-κB：主要表达部位为黏膜层顶端上皮细胞胞浆、肠腺近肠腔侧上皮细胞胞浆、黏膜固有层及黏膜下层结缔组织以及炎性细胞胞浆。模型对照组表达量显著高于空白对照组。各给药组较模型对照组NF-κB表达下调，肠炎清高剂量组及SASP组NF-κB表达量显著低于模型对照组。

TLR4：主要表达部位与NFκB的表达部位一致，模型对照组表达量显著高于空白对照组，各给药组较模型对照组表达下调，但未见显著差异。

qRT-PCR结果显示：造模后动物结肠组织TLR4mRNA的表达量有所升高，但未见显著差异。与模型组相较，各给药组TLR4mRNA表达均有不同程度的下调，但未见显著差异。

4讨论

TLR4是人类发现的第一个TLR相关蛋白，主要表达在参与宿主防御功能的细胞上。TLR4最突出的生物学功能是促进细胞因子的合成与释放，引发炎症反应。其介导炎症发生的相关机制目前已经研究得比较透彻，TLR4识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecule pattern，PAMPS）并与之结合，经下游的信号转导通路最终导致 NF-κB 的激活，引发白 细 胞 介 素-1（IL -1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性因子的释放，介导炎症的发生。

TLR4通过两条经典的信号转导通路激活 NF-κB：My D88 依赖性和My D88 非依赖性信号转导路径。MyD88 是含有TLR 结构域的接头蛋白，是TLR 信号通路的下游信号因子，在TLR 信号通路中有关键性的作用[5-6]。其结构上有3 个功能区域：N 端的死亡区（deathdomain，DD）；与Toll 样受体同源结构域结合的羧基末端及C 端的类似于IL-1 受体胞质区的Toll 区。DD与白细胞介素-1 受体相关激酶（interleukon-1 receptorassociated kinase，IRAK）的死亡结构域结合，并引起IRAK 的自身磷酸化，再经过一系列的激活反应，最终引起I-κB 的活化，导致NF-κB 的激活和转位，造成炎性细胞因子的合成与释放，从而诱发机体本身的炎症反应过程。

NF-κB在UC的发生、发展中是一种重要的转录因子，是多种信号转导途径的汇聚点，在调节炎性反应的基因中起关键作用[7]。实验研究发现各种与UC相关的细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8可通过启动NF-κB等转录因子诱发或加剧机体的炎症反应[8]。NF-κB的激活导致TNF-α、IL-1β转录增加，而TNF-α、IL-1β的释放又进一步激活NF-κB。后者通过正反馈进一步增加TNF-α、IL-1β的分泌，同时使IL-6和IL-8等的表达亦增加。由此产生级联反应，使炎症不断放大，形成“瀑布效应”。有研究表明[9]应用NF-κB抑制剂能改变患者的炎症状态。

本研究结果显示，与模型组比较，肠炎清对TLR4、NF-κBp65蛋白表达、TLR4mRNA表达出现不同程度下调，其中，肠炎清高剂量组与SASP组显著下调NF-κBp65表达，证明肠炎清高剂量组与SASP组一样，对ICUC大鼠可以抑制炎症反应，减少结肠黏膜损伤。

由此判断，下调TLR4、NF-κBp65蛋白表达、TLR4mRNA表达，是肠炎清的作用机制之一。但要明确肠炎清治疗IBD的作用靶点，还需要做更为深入和全面的研究。

参考文献：

[1]吕永慧肠炎清对大鼠溃疡性结肠炎肠黏膜介素-10 和细胞间黏附分子-1 的影响[J].南方医科大学学报，2008，28（10）：1891-1896

[2]吕永慧，胡品津，陈文红中药肠炎清治疗小鼠葡聚糖硫酸钠所致结肠炎的机制[J].世界华人消化杂志，2006，14：1283-7

[3]吕永慧，陈文红，胡品津肠炎清治疗葡聚糖硫酸钠结肠炎的实验研究[J].广州中医药大学学报，2003，20：140-2

[4]程晓磊，杜立阳，刘清芳复方青黛颗粒对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠toll 样受体2，4基因表达的影响[J].中国中西医结合消化杂志，2011，19（1）：14-17

[5]Nagpal K，Plantinga TS，Wong J，et alA TIR domain variant of MyD88adapter-like（Mal）/TIRAP results in loss of MyD88 binding and reduced TLR2/TLR4signaling[J].J Biol Chem，2009，284（38）：25742-25748

[6]Takeuchi O，Takeda K，Hoshino K，et alCellular responses to bacterial cellwall components are mediated through MyD88-dependent signaling cascades[J].Immunol，2000，12（1）：113-117

[7]陈吉，高美丽，白晓茹，等核因子-κB和细胞因子在溃疡性结肠炎中的表达及其意义[J].世界华人消化杂志，2009，17（2）：209-212