斑马鱼幼鱼运动行为测试评价饮用水安全

潘睿捷，黄文平，张斌，徐挺，尹大强

长江水环境教育部重点实验室，同济大学环境科学与工程学院，上海 200092



斑马鱼幼鱼运动行为测试评价饮用水安全

潘睿捷，黄文平，张斌，徐挺#，尹大强

长江水环境教育部重点实验室，同济大学环境科学与工程学院，上海 200092

饮用水安全直接关乎人类的健康与安全，当前迫切需要全新的毒性测试方法对饮用水的潜在人类健康风险进行全面、准确和灵敏的评估和预警。本研究以反渗透技术(RO)取代常用的固相萃取，分别浓缩饮用水厂的进厂水、出厂水和管网水进行毒性试验水样的前处理。反渗透技术前处理方法可以避免传统固相萃取方法中使用的有机溶剂对行为学测试体系的干扰。RO浓缩后的饮用水对斑马鱼胚胎进行持续暴露，采用Viewpoint行为测试软件量化分析出生后第6天(6 dpf)斑马鱼幼鱼的运动行为，选择运动距离和转向行为作为测试终点，分析进厂水、出厂水及管网水的潜在毒性及可能变化。结果表明，暴露在进厂水的幼鱼出现了明显的行为变化，尤其在较高浓度(20倍浓缩)暴露时，运动距离相比对照组显著减少，同时伴有剧烈的转向等异常行为；管网水对斑马鱼幼鱼行为存在一定程度的影响，而出厂水对幼鱼的运动行为没有显著影响。研究结果反映出当前饮用水厂深度处理工艺可以有效降低进厂水的潜在毒性和健康风险，但是经供水管网输送后，其水质可能发生了改变，导致管网水可能存在潜在的毒性。本研究所采用的反渗透技术前处理技术及斑马鱼幼鱼的运动行为学测试方法，可用于未来建立评估饮用水水质安全的早期预警系统。

饮用水安全；斑马鱼；行为学测试；反渗透

淡水资源是关乎人类生存和经济社会发展的重要资源，水质的安全与否直接影响生态系统安全和人类健康[1-2]。我国长期存在饮用水水质安全问题[3]，传统以理化分析为基础的水质检测方法已无法直接、全面地反映水中各种有毒物质的生态和人类健康风险，生物毒性测试在水质检测中的意义得到越来越多的关注。然而饮用水不同于一般地表水，具有污染物含量低但暴露量大、周期长的特点，迫切需要灵敏快速的新型毒理学指标对于水体的潜在毒性和健康影响加以准确表征和预警。行为学效应被认为是生物个体表观效应中最敏感的一类指标[4-10]，也是研究环境污染物暴露所导致神经毒性的表观效应的有效工具。随着基于视频追踪技术的商业化系统的普及，鱼类运动行为的定量化测试近年来已得到药理学、毒理学等领域的普遍认可和快速发展[4,11-12]。目前对行为学的研究以运动行为为主[13-14]，例如，典型中枢神经抑制剂乙醇的高剂量暴露会导致斑马鱼幼鱼呈现运动行为减退的现象[4]等。而对于幼鱼转动行为等其他类型行为学指标的研究仍然较少。

反渗透(reverse osmosis，RO)是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作，常作为水质净化技术用于净化海水和苦咸水[15]。在20世纪90年代，有学者提出采用RO技术进行水中天然有机质的富集，RO是唯一能够以最少损失快速富集大量水中可溶性有机物的方法[16-17]。且研究表明绝大多数重金属和无机盐无法通过RO膜[15-16,18-19]。对于饮用水这种本底效应可能极低的待测物，RO比目前常用的固相萃取技术更加合适用于水样的前处理。

本研究以斑马鱼幼鱼为受试生物，利用反渗透技术浓缩饮用水，通过量化分析不同浓缩倍数饮用水处理下幼鱼的行为学效应，测定饮用水厂进厂水、出厂水和管网水的潜在毒性。研究表明行为学指标在指示饮用水安全性上具备足够的灵敏度，并有助于筛选水中未确定的具有生态或健康风险的污染物。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 饮用水采样和暴露液配制

饮用水样本取自以太湖为水源的某中型水厂，该水厂的处理工艺为取水-预加氯处理-预臭氧接触池+生物氧化池-平流沉淀池-V型砂滤池-深度处理-水库-二级泵房-出厂。水样包括2015年7月至8月的进厂水、出厂水和管网水，其中进厂水来自预加氯处理前，出厂水为水厂深度处理后出水，管网水来自距离水厂下游3 km处某小区。水样的浓缩方法为反渗透，原始浓缩倍数为100倍。如图1所示，整个采样装置由蠕动泵、过滤罐、反渗透装置与数跟软管组成。将进水端与蠕动泵的一端相连接，蠕动泵与前置过滤罐相连接，过滤罐与反渗透装置相接连。浓缩水管置于进水端，使浓缩水回流。渗透水作为废水流出。

图1 反渗透浓缩水样方法示意图Fig. 1 The scheme of reverse osmosis for concentrating water samples

在反渗透之前，先将前置过滤罐注满水，将浓缩水阀门开至最大，开动蠕动泵，清洗装置30 min。调节阀门使系统产生压力，开始反渗透。当阀门调节到压力最适宜时，开始反渗透浓缩水样。浓缩过程中始终保持压力恒定，渗透水流出速率恒定。

进厂水浓缩液、出厂水浓缩液、管网水浓缩液均分别用灭菌纯净水稀释至1%、5%和20%，对应浓缩倍数为1倍(1×)、5倍(5×)和20倍(20×)的水厂进厂水、出厂水及管网水。空白对照为灭菌纯净水。

1.2 斑马鱼胚胎暴露

野生型Tuebingen斑马鱼(Danio rerio)饲养在封闭的循环系统中，饲养条件为28.5 °C，光照时间:黑暗时间为14 h:10 h。每日早晚各喂食丰年虾1次。收集斑马鱼胚胎时，将斑马鱼以雌雄比1:2置于孵育盒中，待次日收集斑马鱼胚胎。收集的斑马鱼胚胎立即以灭菌水冲洗，并利用SZX-16型立体显微镜(Olympus，Japan)挑选发育正常且到囊胚期的胚胎进行暴露实验。

将挑选好的胚胎置于含有6 mL暴露液6孔板中，每个孔30枚胚胎，并将6孔板置于MGC-100P型恒温光照培养箱(一恒，中国)中培养，培养条件同斑马鱼饲养条件。暴露24 h后，从每个暴露液各挑选24枚胚胎转移至含有该暴露液2 mL的96孔板中，每个孔1枚胚胎。每天更换一半暴露液，并挑出死亡的胚胎或幼鱼。总暴露时间为6 d。暴露过程中胚胎和幼鱼存活率均达90%以上。

1.3 斑马鱼幼鱼行为学试验

行为学试验包括运动行为测试和转动行为测试，前者主要分析幼鱼运动总量和轨迹，后者则分析幼鱼在游动时的转动角度及次数。出生后第6天(6 dpf)幼鱼的运动行为均通过Zebrabox观察箱(Viewpoint，France)检测，采用Viewpoint Application Manager软件记录和量化运动数据。斑马鱼行为学的测试时长为70 min。起始10 min为光照适应，随后10 min的黑暗和光照等时长交替刺激，共3个周期[20]。斑马鱼运动数据的原始最小记录间隔为1 s。

斑马鱼幼鱼在正常行进时，尾部摆动频率较低，身体角度变化幅度不大[21-22]；只有当幼鱼遇到外源性刺激等异常情况时才会出现大幅转向[23]。基于上述原因，本研究将斑马鱼行进角度-10°～10°之间定义为无转向，±10°～±90°定义为一般型转向，±90°～±180°定义为刺激型转向。

1.4 数据统计分析

以每10 min的运动距离总和(cm)和每2 min的运动距离总和(cm)等2项指标来表示斑马鱼幼鱼的运动行为。试验结果以平均值(mean)±标准误(standard error of mean, SEM)来表示。转动行为试验则统计斑马鱼幼鱼在不同角度范围内的转动次数，单位为千次。

数据的统计分析和作图采用Mocrosoft Excel和Graphpad Prism软件进行，统计方法上采用双因素方差分析(two-way ANOVA)检验不同处理组与对照组之间的差异。若P<0.05，则认为具有显著性差异。

2 结果(Results)

2.1 进厂水对斑马鱼幼鱼运动行为的影响

进厂水对斑马鱼幼鱼第6天运动行为的影响见图3。测试的结果显示出，3种浓缩液均造成斑马鱼幼鱼一定程度的运动减退，且影响主要发生在光照周期内。但是，幼鱼的运动减退程度并未呈现出浓度依赖性，特别是在最后2个光照周期内5×组的幼鱼发生了显著的运动减退(P<0.05)。黑暗周期内仅有1×组的幼鱼发生了显著的运动减退(P<0.05)，其余组别均未出现显著性影响。

进厂水对斑马鱼幼鱼第6天转动行为的影响见图4。相比于对照组，3个暴露组中斑马鱼幼鱼的总转动次数均明显增加。在1×组中，幼鱼的转动次数虽然明显增多，但行进角度的分布仍基本与对照组保持一致。随着暴露浓度上升，斑马鱼幼鱼在-10°～10°的转动次数不断减少，在±90°～180°的转动次数不断增加，在角度分布中所占的比例也不断升高。20×组的斑马鱼在±90°～180°的转动次数甚至远高于在±90°之间的转动次数，与其他组别斑马鱼幼鱼的转动行为截然相反。

图2 斑马鱼幼鱼行为学检测示意图Fig. 2 The scheme of behavior experiment on zebrafish larvae

图3 进厂水对斑马鱼幼鱼运动行为的影响注：A图，每10 min运动距离总和；B图，每2 min运动距离总和。C，对照组；1×，原水样；5×，5倍浓缩水样；20×，20倍浓缩水样。下同。Fig. 3 The locomotion of zebrafish larvae exposed to inlet waterNote: A, total distance in 10 min; B, total distance in 2 min. C, control; 1×, original water sample; 5×, 5 times concentrated; 20×, 20 times concentrated. The same below.

图4 进厂水对斑马鱼幼鱼转动行为的影响(单位：千次)Fig. 4 The path angle and the turning frequency (×103 times) of zebrafish larvae exposed to inlet water

图5 出厂水对斑马鱼幼鱼运动行为的影响Fig. 5 The locomotion of zebrafish larvae exposed to output water

2.2 出厂水对斑马鱼幼鱼运动行为的影响

出厂水对斑马鱼幼鱼第6天运动行为的影响见图5。出厂水暴露基本未对幼鱼的运动能力造成显著性影响。仅仅在50 min这个光照周期内，幼鱼的运动量与对照组相比出现了显著减少(P<0.05)。

出厂水对斑马鱼幼鱼第6天转动行为的影响见图6。所有组别在测试周期内斑马鱼幼鱼行进角度的分布高度相似。对照组与1×组和5×组的斑马鱼幼鱼总转动次数无明显差别，20×组的斑马鱼幼鱼总转动次数则最少，这种减少主要发生在-90°～90°区段内。所有组别的幼鱼均极少发生转角大于±90°的变向。

2.3 管网水对斑马鱼幼鱼运动行为的影响

管网水对斑马鱼幼鱼第6天运动行为的影响见图7。测试的结果与进厂水对斑马鱼幼鱼的结果相似。3种浓缩液均造成斑马鱼幼鱼一定程度的运动减退，且影响主要发生在光照周期内，且幼鱼的运动减退程度并未呈现出浓度依赖性。黑暗周期下的所有暴露组的幼鱼均未出现显著性影响。

图6 出厂水对斑马鱼幼鱼转动行为的影响(单位：千次)Fig. 6 The path angle and the turning frequency (×103 times) of zebrafish larvae exposed to output water

图7 管网水对斑马鱼幼鱼运动行为的影响Fig. 7 The locomotion of zebrafish larvae exposed to tap water

图8 管网水对斑马鱼幼鱼转动行为的影响(单位：千次)Fig. 8 The path angle and the turning frequency (×103 times) of zebrafish larvae exposed to tap water

管网水对斑马鱼幼鱼第6天转动行为的影响见图8。所有组别在测试周期内斑马鱼幼鱼行进角度的分布高度相似。暴露组幼鱼的行进转角次数均高于对照组，且呈现出浓度依赖性，1×组的斑马鱼总转动次数最多。这种增加主要发生在-90°～90°区段内。所有组别的幼鱼均极少发生转角大于±90°的变向。

3 讨论(Discussion)

固相萃取是地表水水检测预处理的常用方法[24-25]，其虽能有效地对水样进行高倍数的浓缩，但由于需要引入甲醇、乙腈等毒性有机溶剂，对毒性测试产生了一定干扰。此外，固相萃取中的填料对物质具有选择性，容易造成物质损失[26-27]。饮用水作为一个混合体系，使用RO不仅可以避免毒性有机溶剂的添加，也能够尽可能富集水样中存在的各类物质，避免富集时所产生的物质损失，保证水样尽可能接近真实。尽管RO的浓缩倍数相对固相萃取法较低，但通过不断循环回流浓缩水的方式，可明显提高RO的浓缩倍数。Pressan等[28]在一项检测饮用水厂沉砂池出水中天然有机物的研究中，使用的RO富集倍数为165倍，本试验中的浓缩倍数也达到100倍。在采样量充足的情况下，不会影响后续分析和毒性测试。

通过3种水样测试结果的对比，我们发现出厂水无论在运动行为还是转动行为测试中均未对斑马鱼幼鱼的行为造成显著性影响。进厂水暴露对幼鱼行为产生了最为显著的影响，其具体表现为运动距离减少，转动次数增加；而且在转向行为的分布上，出现了一定的浓度依赖性。对比进出厂水幼鱼运动行为测试结果，太湖微污染原水经过水厂深度处理后，其潜在毒性有效降低，健康安全得到保障，该水厂监测数据显示出水达到国家《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)。现行的鱼类运动为毒性测试常以运动距离为测试终点，本研究提出以转动次数结合运动距离共同作为测试终点。Van Leeuwen等[21-22]发现，斑马鱼幼鱼在无外界干扰时转向幅度较小，行径近似于直线；而当受到外源性刺激时则可能出现大幅转向的回避行为[23]，表现为一种“C”型运动[29]。本次研究中，幼鱼在浓缩进厂水暴露时频繁出现大角度的转体，意味着可能存在因水体污染而产生的典型回避反应。

特别值得注意的是管网水暴露时，可观察到在一些浓缩水样处理组幼鱼运动距离的降低和转动次数增多，即出厂水经过管网输送后改变了幼鱼的行为模式。近些年，供水管网水质污染的问题逐步得到重视，一些研究表明供水管网会在饮用水流经过程中向水体释放重金属、微生物、有机污染物等，由饮用水厂带出的部分消毒副产物也会出现含量升高的现象，从而对饮用水水质造成管网二次污染[30-33]。本研究中幼鱼在管网水暴露时的行为变化则切实反映出水体成分的改变可能带来潜在的健康和安全风险。

综上所述，本研究采用反渗透浓缩水样，避免了有机溶剂对测试系统的干扰，采用斑马鱼幼鱼运动距离和转向行为为行为学指标，具有较高的灵敏度，是一种比较合适的新型饮用水毒性测试方法。研究表明，当前饮用水厂深度处理工艺可以有效降低进厂水的潜在毒性和健康风险，保证饮用水安全。同时，供水管网系统对饮用水水质和安全可能存在的负面影响不可忽视，亟待进行深入研究。

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Toxicity Assessment of Drinking Water Using Zebrafish Swimming Behavior Tests

Pan Ruijie, Huang Wenping, Zhang Bin, Xu Ting#, Yin Daqiang*

Key Laboratory of Yangtze River Water Environment, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering of Tongji University, Shanghai 200092, China

Received 8 March 2016 accepted 26 May 2016

The safety of drinking water is a critical issue for human health and society security. To evaluate the potential health risks of drinking water, it is essential to develop novel methodologies of toxicity tests with high sensitivity and accuracy. In the present study, reverse osmosis, instead of regular used solid-phase extraction technique, was used as the pretreatment method to concentrate inlet water, output water and tap water respectively, which could avoid the potential interference (induced by organic solvent during conventional solid-phase extraction process) to behavior tests. New-born zebrafish embryos were exposed to the concentrated drinking water till they developed to 6 days post-fertilization. Swimming behavior tests (locomotion and path angles) of the zebrafish larvae were then recorded and quantified by an analysis software Viewpoint to evaluate the potential toxicity induced by water borne exposure (including inlet water, output water and tap water). Our results revealed that the inlet water exposed zebrafish exhibited significant behavioral changes. Comparing with the control group, the larvae exposed to the highly concentrated (by 20 times) inlet water significantly reduced their locomotion, accompanied with dramaticaland frequent changes of their swimming direction. Such behavioral changes were less evident for tap water exposed larvae, and not observed in outlet water exposed larvae. Our results revealed that the drinking water treatment process could effectively reduce the potential toxicity of inlet water. Nevertheless, it should be noted that the water supply network might change the water quality and induce toxicity of tap water. Moreover, swimming behavior tests of the zebrafish larvae followed by reverse osmosis technique could be applied to establish novel early-warning system for health risk assessment of drinking water.

drinking water; zebrafish; behavioral effects; reverse osmosis

国家水体污染控制与治理科技重大专项(2015ZX07406-004)

潘睿捷(1989-)，男，硕士研究生，研究方向为生态毒理学，E-mail: 13817843680@126.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: yindq@tongji.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160308004

2016-03-08 录用日期：2016-05-26

1673-5897(2016)4-018-08

X171.5

A

简介：尹大强(1962—)，男，环境科学博士，教授，主要研究方向环境污染物的生态和人体健康风险。

徐挺(1978-)，男，环境科学博士，副研究员，主要研究环境污染物的发育毒性。

# 共同通讯作者(Co-corresponding author)， E-mail: 412_xuting@tongji.edu.cn

潘睿捷, 黄文平, 张斌, 等. 斑马鱼幼鱼运动行为测试评价饮用水安全[J]. 生态毒理学报，2016, 11(4): 18-25

Pan R J, Huang W P, Zhang B, et al. Toxicity assessment of drinking water using zebrafish swimming behavior tests [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(4): 18-25 (in Chinese)