血管性痴呆大鼠海马区pro-BDNF、截短型BDNF、mBDNF的变化及与认知的关系

张露，李俊敏，梁锐，张博爱

（1.郑州大学第一附属医院神经内科，河南 郑州 450052；2.河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052）

血管性痴呆大鼠海马区pro-BDNF、截短型BDNF、mBDNF的变化及与认知的关系

张露1，李俊敏1，梁锐2，张博爱1

（1.郑州大学第一附属医院神经内科，河南 郑州 450052；2.河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052）

目的探讨血管性痴呆（VD）大鼠海马中脑源性神经营养因子前体蛋白（pro-BDNF）、成熟脑源性神经营养因子（mBDNF）、截短型脑源性神经营养因子（BDNF）变化及与认知功能的关系。方法健康雄性SD大鼠120只，6月龄，体重350 g左右，随机分为模型组和假手术组，模型组结扎双侧颈总动脉，假手术组除不结扎血管外余同模型组，模型组和假手术组大鼠随机分为2、4、8和12周4个时间，水迷宫实验筛选造模成功大鼠，免疫组织化学法和Western blot检测假手术组及造模成功的大鼠不同时间点海马中pro-BDNF、mBDNF、截短型BDNF变化。结果术后各时间点模型组大鼠的潜伏期均较假手术组延长（P＜0.05）。免疫组织化学法检测显示模型组大鼠海马神经元形态改变、数量减少、BDNF表达下降。术后模型组pro-BDNF、mBDNF、截短型BDNF较假手术组降低（P＜0.05），pro-BDNF水平下降趋势较缓慢，截短型BDNF水平下降趋势在缺血早期变化显著，后期变化缓慢；mBDNF水平下降趋势在缺血早期变化不明显，后期变化显著。结论慢性缺血VD大鼠海马区pro-BDNF、mBDNF、截短型BDNF均有改变，3者比例的改变可能与VD大鼠认知功能障碍有关。

脑缺血；海马；脑源性神经营养因子前体蛋白；截短型脑源性神经营养因子；成熟型脑源性神经营养因子

脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是脑神经营养因子家族成员之一，广泛存在于中枢神经系统。近期研究发现，BDNF在哺乳动物内质网中以脑源性神经营养因子前体蛋白（pro-BDNF）的形式合成。pro-BDNF生成后，在细胞内外通过不同的酶水解生成成熟的脑源性神经营养因子（maturebrain-derivedneurotrophicfactor，mBDNF）和截短型BDNF[1]。以前认为pro-BDNF和截短型BDNF为mBDNF产生过程中的中间产物，没有生物学活性，现在发现其具有生物学功能。pro-BDNF可诱导树突分支和树突棘的密度减小，负性调节突触可塑性，易化长时程抑制，其表达的变化与情感、认知、学习、记忆损害的神经、精神性疾病，如阿尔茨海默病、精神分裂症和严重抑郁障碍等有关[2-3]。而mBDNF可促进神经元的存活、正性调节突触可塑性，诱导长时程增强，有研究表明其与认知功能密切相关，能明显改善痴呆大鼠的认知功能[4-5]。截短型BD NF作用机制尚不明确，但近期有研究发现截短型BDNF血清水平升高与精神分裂症患者的认知功能减退有关系[6]。研究结果均提示，pro-BDNF、mBDNF、截短型BDNF可能与认知功能有关，目前，国内外研究血管性痴呆（Vasculardementia，VD）及BDNF均集中在mBDNF，关于pro-BDNF及截短型BDNF尚未见报道。本实验探讨pro-BDNF、mBDNF、截短型BDNF与VD大鼠认知障碍的关系，以及3者含量比例的变化对认知的影响，为VD发病机制研究提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1实验动物健康SD雄性大鼠120只，6个月龄，体重350 g左右，由郑州大学医学院动物实验中心提供，随机分为模型组和假手术组，分笼饲养，室内常温下配方饲料喂养，自由饮食水。适应环境1周后实验，每组取2、4、8和12周4个时间。

1.1.2主要试剂Anti-BDNF（兔抗大鼠）（美国Abcam公司），山羊抗兔免疫球蛋白G（武汉博士德公司），免疫组织化学法试剂盒（北京博奥森公司），兔抗大鼠β-actin、聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白定量试剂盒、放射免疫沉淀裂解液等试剂均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2仪器与设备

Morris水迷宫仪购自北京硕林宛科技有限公司，高速低温离心机购自上海手术器械厂，多功能酶标仪购自瑞典Tecan公司，倒置相差显微镜购自日本Olympus公司，眼科镊、眼科剪、无菌线、缝合针等购自上海手术器械厂。

1.3实验方法

1.3.1VD模型复制参照马兴荣等[7]的方法复制脑缺血大鼠模型。大鼠术前12 h禁食，4 h禁水。10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，去毛消毒后，沿颈正中切开，逐层钝性分离出双侧颈总动脉，分别结扎双侧颈总动脉远心端和近心端，确保阻断颈总动脉血流后缝合皮肤。假手术组动物除不结扎颈总动脉外，余过程与模型组相同。

1.3.2行为学评价及造模成功的标准术后2、4、8和12周开始，分别将各组动物置于Morris水迷宫中进行定位导航训练4 d，每天训练3次，每次在不同的入水点训练120 s，第5天分别记录每只动物的潜伏期，潜伏期越短，路程越近，说明大鼠的学习记忆能力越好[8]。以第5天假手术组大鼠潜伏期的均值为参考值，计算模型组大鼠第5天的平均潜伏期与参考值之差占该大鼠平均潜伏期时间的比值，比值＞20%为认知功能障碍大鼠，潜伏期越长认知损害越严重[8]。

1.3.3BDNF的免疫组织化学检测大鼠于各时间点麻醉，暴露心脏，生理盐水快速灌注至流出无血色液体，4%多聚甲醛灌注固定，充分将前液置换后开颅取脑，放入4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，取海马区切片。依次烤片、脱蜡水化、抗原修复、封闭，一抗（1∶300）孵育4℃过夜，二抗室温孵育20 min，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，脱水透明封片。磷酸缓冲盐溶液代替一抗设阴性对照组。倒置显微镜观察神经元变化。

1.3.4蛋白样品的制备及Western blot检测于各时间点冰上取出大鼠海马，加组织裂解液，回旋振荡器匀浆后冰上裂解20 min，14 000 g，4℃离心10 min，取上清液，二喹啉甲酸法测蛋白浓度后加上样缓冲液100℃变性5 min后置入-20℃冰箱冷冻保存备用。Western blot检测：等量蛋白上样，聚丙烯酰胺电泳分离蛋白，湿转至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭，兔抗大鼠BDNF抗体（1∶2 000）4℃过夜，HRP-山羊抗兔抗体（1∶10 000）室温孵育2 h，增强化学发光法显色，曝光，定影显影。以β-actin作为内参对照组，扫描胶片后用Image J分析条带。1.4统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，模型组与假手术组各时间点指标的比较，用独立样本t检验，模型组内各时间点指标的比较，用单因素方差分析，方差齐，方差分析有显著性时用LSD-t检验进行多重比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1VD模型复制结果

复制模型组大鼠65只，实验过程中共死亡16只；复制假手术组大鼠55只，实验过程中共死亡4只。

2.2各组大鼠行为学改变

模型组大鼠潜伏期明显延长，与假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.05），表明模型组大鼠学习记忆能力受损，出现一定的认知功能障碍。模型组内比较行单因素方差分析，差异有统计学意义（F= 14.63，P=0.000），表明随缺血时间延长，认知功能障碍逐渐加重。见表1。

表1　模型组与假手术组大鼠不同时间点潜伏期比较（n=12，s±s）

表1　模型组与假手术组大鼠不同时间点潜伏期比较（n=12，s±s）

注：1）与术后2周比较，P＜0.05；2）与术后4周比较，P＜0.05；3）与术后8周比较，P＜0.05

组别2周4周8周12周模型组22.54±4.62 39.58±17.011）53.26±10.511）69.60±11.221）2）3）假手术组13.99±4.9115.47±6.5915.24±3.9118.65±4.52 t值2.8362.9557.5799.417 P值0.0220.0180.0000.000

图1　大鼠海马区BDNF表达（免疫组织化学法）

2.3大鼠海马区BDNF的表达

免疫组织化学法检测示模型组海马区神经元胞体变大，轮廓清晰度减退，神经元数量减少，随缺血时间延长细胞阳性率降低越明显。见图1。

Western blot检测：①组间比较。模型组pro-BDNF在缺血早期减少不明显，缺血晚期明显低于假手术组（P＜0.05）；截短型BDNF在缺血早期就开始减少（P＜0.05）；mBDNF在缺血晚期明显减少（P＜0.05），早期减少不明显。②组内比较。假手术组组内比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组组内分析发现，模型组pro-BDNF的下降趋势较缓慢（相邻时间点间差异无统计学意义）；截短型BDNF的下降趋势在2和4周间最明显（P＜0.05）；mBDNF的下降趋势在8周后较明显（P＜0.05）。见图2和表2～4。

图2　两组大鼠各时间点BDNF相对灰度值比较（n=6±s）

表2　两组大鼠的pro-BDNF表达比较（n=6±s）

表2　两组大鼠的pro-BDNF表达比较（n=6±s）

注：模型组内方差分析：F=10.415，P=0.000。1）与术后2周比较，P＜0.05；2）与术后4周比较，P＜0.05

组别2周4周8周12周模型组0.644±0.078 0.590±0.068 0.480±0.0091）2）0.376±0.0831）2）假手术组0.658±0.055 0.664±0.0590.654±0.0600.666±0.051 t值0.3281.8303.3766.667 P值0.7510.1050.0100.000

表3　两组大鼠的截短型BDNF表达比较（n=6，±s）

表3　两组大鼠的截短型BDNF表达比较（n=6，±s）

注：模型组内方差分析：F=8.978，P=0.001。1）与术后2周比较，P＜0.05；2）与术后4周比较，P＜0.05

组别2周4周8周12周模型组0.350±0.071 0.264±0.0521）0.220±0.0551）0.172±0.0441）2）假手术组0.372±0.0540.366±0.0680.380±0.0540.374±0.060 t值0.5552.6684.6386.036 P值0.5940.0280.0020.000

表4　两组大鼠的mBDNF表达比较（n=6±s）

表4　两组大鼠的mBDNF表达比较（n=6±s）

注：模型组内方差分析：F=15.907，P=0.000。1）与术后2周比较，P＜0.05；2）与术后4周比较，P＜0.05；3）与术后8周比较，P＜0.05

组别2周4周8周12周模型组0.530±0.056 0.470±0.061 0.386±0.0621）2）0.296±0.0491）2）3）假手术组0.508±0.122 0.506±0.120 0.508±0.1280.522±0.134 t值0.3690.5981.9193.551 P值0.7220.5660.0910.007

3 讨论

既往研究表明，大鼠2VO术后2周海马血流量下降至78.4%，术后4周下降至66.3%，术后8周血流量下降约4.00%，脑低血流状态转变为慢性状态[9-10]，而慢性脑缺血又是VD最常见的病因[11]，因此以2VO大鼠为实验动物模型来模拟VD。本实验通过Morris水迷宫测量大鼠逃避潜伏期来评价大鼠认知功能，发现模型组大鼠在脑缺血2周时已经有认知功能损伤，且随着缺血时间的延长，大鼠的认知功能下降越明显，与之前的研究报道一致[12]。

本实验中笔者通过免疫组织化学法发现VD大鼠海马区神经元外形发生改变，总BDNF的表达有变化，且缺血时间越长，总BDNF水平越低。推测海马供血不足会使海马区总BDNF含量减少，并对海马神经元形态结构有一定的影响。pro-BDNF和mBDNF的比例在不同的生长发育阶段是不同的，pro-BDNF的比例在新生儿期最高；其次是青春期；成年期最低[13]。近期发现，pro-BDNF广泛存在于中枢神经系统，且在老龄大鼠海马中大量聚集[14]。但截短型BDNF水平的变化尚未见报道。本实验中笔者发现，假手术组大鼠海马区BDNF各亚型在术后未见明显变化，推测在6～10个月龄的大鼠海马区BDNF各亚型的水平基本稳定。模型组大鼠海马区pro-BDNF、截短型BDNF和mBDNF表达均发生改变，但变化趋势不同。脑缺血8周开始pro-BDNF有明显变化，至脑缺血12周其变化与8周比较不明显。表明慢性脑血缺后pro-BDNF的表达变化很缓慢。而截短型BDNF蛋白水平在脑血缺后4周即开始有明显下降，8周后下降趋势变缓，其变化趋势与舒怡等[9]提出的大鼠2VO术后海马血流量变化趋势相符合。表明海马区截短型BDNF的变化易受海马区血供的影响。mBDNF在缺血8周后开始有明显变化，缺血12周后其水平明显低于8周，笔者推测只有海马区血供减少到一定程度后才会对mBDNF水平有一定的影响。

此外，本实验中笔者还发现，模型组大鼠认知功能障碍的变化趋势与截短型BDNF变化趋势基本一致，模型组大鼠认知功能明显减退也是术后4周开始，推测大鼠海马区截短型BDNF的减少可能与大鼠认知功能减退关系密切。体内外实验已证明mBDNF可以启动和维持长时程增强，在学习和记忆形成中是不可或缺的[15-16]；pro-BDNF诱导长时程抑制形成记忆的消退，两者共同调节大脑现有的记忆[17-18]。但VD大鼠脑缺血8周时两者均减少，而VD大鼠认知功能的损害并没有因此与4周有明显差异，推测可能该时间pro-BDNF和mBDNF的表达变化对该时期VD大鼠海马神经元功能影响不大。VD大鼠脑缺血12周时，其认知功能减退与截短型BDNF变化趋势稍有不同，推测可能pro-BDNF和mBDNF表达的减少不足以维持该时期VD大鼠海马神经元的功能活动，更加重认知功能的减退。

综上所述，在慢性缺血VD大鼠海马区pro-BDNF、mBDNF和截短型BDNF表达均发生改变，3者比例的改变可能与VD大鼠认知功能减退有关。在VD大鼠早期，认知功能减退可能与截短型BDNF减少关系密切，而在晚期可能与3者的减少均有关系。但是在慢性缺血性VD大鼠8周前认知功能的减退是否受pro-BDNF和mBDNF变化的影响尚不明确，截短型BDNF的作用机制尚不清楚，仍需进一步研究。

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（申海菊 编辑）

Changes of pro-BDNF,mature BDNF and truncated BDNF in hippocampus of vascular dementia rats

Lu Zhang1,Jun-min Li1,Rui Liang2,Bo-ai Zhang1
(1.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou, Henan 450052,China;2.Institute of Clinical Medical Research,Henan University, Zhengzhou,Henan 450052,China)

Objective To investigate the changes of pro-brain-derived neurotrophic factor(pro-BDNF), mature BDNF and truncated BDNF in hippocampus of vascular dementia rats.Methods A total of 120 healthy male Sprague-Dawley rats aged 6 months and weighting 350 g were randomly divided into model group and sham-operation group.The model of chronic cerebral ischemia was established by permanent occlusion of the bilateral common carotid arteries(2VO)in rats,while the sham-operation group accepted the same operation except occlusion of the bilateral common carotid arteries.The rats of both model group and sham-operation group were randomly divided into 2-week,4-week,8-week and 12-week sub-groups,and the behavior of the rats in each group was evaluated by the Morris water maze to select the successful modeling, then the brains were collected for immunohistochemistry and Western blot to detect the changes of pro-BDNF, mature BDNF and truncated BDNF in the hippocampus.Results The escape latency of the rats in the modelgroup was significantly extended compared with the sham-operation group(P＜0.05).Compared with the sham-operation group,the total BDNF of the model group reduced gradually with the prolonged ischemic time,and the truncated BDNF in the model group significantly reduced in 4 weeks,8 weeks and 12 weeks (P＜0.05),and pro-BDNF significantly reduced in 8 weeks and 12 weeks(P＜0.05),and mature BDNF significantly reduced in 12 weeks(P＜0.05).Conclusions Pro-BDNF,mature BDNF and truncated BDNF have changed in the hippocampus of chronic cerebral ischemia rats,and the change in the proportion of three isoforms of BDNF may be associated with cognitive dysfunction.

cerebral ischemia;hippocampus;pro-BDNF;truncated brain-derived neurotrophic factor;mature brain-derived neurotrophic factor

R749.13

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.21.002

1005-8982（2016）21-0008-05

2016-02-22