番茄红素预处理对肢体缺血再灌注后肠黏膜的保护研究

王西岩，卓 睿，宋 强，杨悦璠，汪 益，罗 兰，杨 拯

成都医学院 基础医学实验教学中心 (成都 610500)



·论 著·

番茄红素预处理对肢体缺血再灌注后肠黏膜的保护研究

王西岩，卓 睿，宋 强，杨悦璠，汪 益，罗 兰，杨 拯△

成都医学院 基础医学实验教学中心 (成都 610500)

目的 观察番茄红素预处理对肢体缺血再灌注后肠黏膜的保护作用，并探讨其可能的作用机制。方法 健康成年SD大鼠24只，雌雄不限，随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、番茄红素低剂量组(C组)、番茄红素高剂量组(D组)。C组灌胃番茄红素5 mg/kg，D组灌胃番茄红素25 mg/kg，A组和B组灌胃等量色拉油，连续7 d。采用止血带捆绑大鼠左后肢，建立缺血3 h后，再灌注18 h肢体缺血再灌注损伤大鼠模型，A组大鼠以同样的方法进行造模，但不予结扎。打开腹腔，取回肠末端肠段固定，并于腹主动脉取血，离心保存。HE染色观察各组大鼠肠黏膜的形态变化，测定血清二胺氧化酶(DAO)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果 与A组比较，B组大鼠肠黏膜损伤明显加重，血清DAO和MDA含量明显增加(P<0.01)，SOD活性降低(P<0.05)；与B组比较，C组大鼠肠黏膜损伤减轻(P<0.01)，血清DAO和MDA含量降低(P<0.05)；D组大鼠肠黏膜损伤减轻，DAO含量减少(P<0.01)，血清SOD活性升高，血清MDA含量减少(P<0.05)。与C组比较，D组血清DAO含量减少，血清MDA含量降低(P<0.05)；血清SOD活性升高，肠黏膜损伤稍减轻，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 番茄红素可通过抗氧化减轻肢体缺血再灌注后肠黏膜的损伤程度。

番茄红素； 肢体缺血再灌注； 肠黏膜

肢体缺血再灌注(LI/R)是指肢体在缺血基础上恢复血供，未减轻缺血组织的损伤，反而会使肢体结构、功能、代谢异常加重的现象[1-3]，在临床上主要见于四肢大血管的血栓栓塞、断肢再植、车祸挤压伤和长时间使用止血带等[4-5]。LI/R是临床上常见的症状，据有关统计[6]，其导致的伤残率高达26.4%，但因药物副作用或疗效等原因，在临床上没有广泛使用的药物。LI/R的病理改变主要包括自由基损伤、钙超载、炎性因子的释放、细胞凋亡、微循环血液流变学的改变等[7-9]。这些病理改变主要发生在再灌注期，故再灌注期对机体的损伤大于缺血期。研究[10-11]表明，LI/R不仅会引起缺血肢体的损伤，也会引起远隔重要器官的损伤，其损伤类似于缺血肢体，仍是再灌注期损伤更严重。而在一系列的损伤机制中，氧自由基损伤是各损伤的关键环节[12]。因此，如何有效预防和减轻这种损伤是基础与临床上较为热点的问题之一。

番茄红素是一种具有强抗氧化性的天然类胡萝卜素，其抗氧化性是常用的抗氧化剂β-胡萝卜素的2倍多，是维生素E的100倍[13]。部分氧自由基药物因其强大的毒副作用，未能在临床得到广泛应用。番茄红素为天然保健品，对机体几乎无毒副作用[14]，因此，本研究探讨了番茄红素对LI/R损伤后肠道可能的保护作用及机制， 旨在为减轻LI/R损伤寻找一种新途径和提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

6%番茄红素油树脂(新疆瑞德莱福生物科技有限公司)，批号：HY1007261；水合氯醛(成都市科龙化工试剂厂，批号：20100920)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20130709)；丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20130709)；二胺氧化酶(DAO)试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司，批号：201306)；TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；721E型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；Eclipse E200光学显微镜(尼康仪器有限公司)；TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；680酶标仪、洗板机(BIO-RAD，USA)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 健康、清洁级成年SD大鼠24只， 雌雄不限，体质量(220±20) g，由四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所提供。实验大鼠适应性饲养1周后用于实验。将24只SD大鼠随机分为4组：假手术组(A组)、模型组(B组)、 番茄红素低剂量组(C组)、番茄红素高剂量组(D组)， 每组各6只。

1.2.2 实验大鼠一般状态观察 对老鼠进行分笼饲养，给予等量饲料，自由饮水，每天观察各组实验大鼠的毛发、精神状态、腹部膨隆、后肢活动等情况。1.2.3 预处理措施 A、B组大鼠每天等量色拉油灌胃；C组大鼠每天同时间点番茄红素5 mg·kg-1·d-1灌胃；D组大鼠每天同时间点番茄红素25 mg·kg-1·d-1灌胃。第6天灌胃后，禁食，自由饮水；第7天灌胃2 h后，开始复制模型。

1.2.4 复制LI/R动物模型 B、C、D组大鼠以10%水合氯醛行腹腔麻醉，Yassin法[15]的基础止血带用统一拉力进行长度标定后造模。以固定拉力强度的止血带，环绕大鼠大腿根部两周，结扎，造成大鼠肢端缺血，持续3 h后，剪断止血带再灌注18 h。A组大鼠以同等拉力强度的止血带环绕大腿根部两周，但不予结扎。

1.2.5 HE染色后光镜下评分 大鼠麻醉后，作中下腹切口，取回盲部以上2 cm小肠，去除肠腔内异物后，置于4%多聚甲醛固定液中，24 h后常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，在光镜下，根据Chiu′s评分标准，采用双盲法，评价小肠黏膜的损伤程度。

1.2.6 DAO、SOD和MDA含量的测定 用戊巴比妥钠将大鼠麻醉后打开腹腔，经腹主动脉取血3 mL， 4 ℃，3 500 r/min，离心半径2.5 cm，离心10 min， 取上清液进行测定，-20 ℃保存备用。采用双抗体夹心法，按照ELISA试剂盒说明书进行相关操作测定DAO；采用黄嘌呤氧化酶法，按照试剂盒说明书配制试剂进行相关操作测定SOD的活性；采用硫代巴比妥酸法，按照试剂盒说明书配制试剂进行相关操作MDA的含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般情况

灌胃前2 d，各组大鼠出现稀便，1～2 d后自然恢复。在灌胃期间，各组大鼠精神状态较好，食量正常，毛色未出现明显异常，较活泼。LI/R后，B、C、D组大鼠起初表现较为亢进，然后精神逐渐萎靡，不进食，毛色较暗，少活动，出现后肢行动不便；A组大鼠未出现明显异常。

2.2 大鼠肠黏膜病理组织学改变

HE染色发现，A组表现为正常绒毛；B组小肠绒毛变钝、排列紊乱，间质水肿明显，并伴有炎细胞浸润(图1)。采用Chiu′s评分法，对评分人员实行双盲，结果发现，B组小肠黏膜损伤评分明显高于A组; C、D组均低于B组(P<0.01)，但高于A组(P<0.05或P<0.01)。D组与C组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

图1 HE染色检测大鼠病理组织学改变(×200)

注：A.假手术组；B.缺血再灌注组；C.番茄红素低剂量组；D.番茄红素高剂量组

2.3 血清中DAO测定结果

血清中DAO浓度的测定发现，与A组相比，B组大鼠血清中DAO浓度明显增高(P<0.01)；与B组比较，C组血清中DAO浓度较降低(P<0.05)，D组血清中DAO浓度明显降低(P<0.01)；与C组相比，D组血清中DAO浓度降低(P<0.05)(表1)。

表1 LI/R大鼠肠黏膜损伤和血清DAO含量

注：与A组比较，△P<0.05，*P<0.01；与B组比较，&P<0.05，#P<0.01；与C组比较;■P<0.05

2.4 血清中SOD、MDA测定结果

通过检测血清中SOD与MDA发现，与A组相比，B组血清SOD活性降低(P<0.05)，MDA浓度明显增高(P<0.01)；与B组相比，C组血清MDA浓度降低 (P<0.05)；D组血清SOD活性升高，MDA浓度降低(P<0.05)；与C组相比，D组血清MDA浓度降低 (P<0.05)(表2)。

表2 大鼠SOD活力及MDA含量

注：与A组比较，△P<0.05，*P<0.01；与B组比较，&P<0.05；与C组比较，■P<0.05

3 讨论

LI/R是一种始于局部而累及全身的临床疾病，在肢体创伤和断肢移植手术中尤为常见，且术后引发肠缺血再灌注损伤发病率较高，是导致其病死率较高的重要因素[16]。LI/R不仅会引起缺血肢体的损伤，还会造成远隔重要脏器的损伤，如心、肝、小肠、肾等，诱发全身炎症反应综合征(SIRS)，甚至发生多器官功能不全综合征(MODS)[17]。当机体发生创伤、感染、休克等应激损伤时，为保证心、脑等重要脏器的供血，全身血液会重新分布，肠道供血急剧减少，造成肠道缺血损伤。有报道[18-20]称，若全身血液减少10%，则胃肠道血流量将减少40%。当肠道恢复供血后，氧经黄嘌呤氧化酶的作用生成氧自由基，大量氧自由基进入血液，造成细胞膜脂质、蛋白质和DNA的损伤。肢体恢复供血后，产生的氧自由基也可通过血液对肠道细胞造成损伤。小肠是人体最大的细菌和内毒素的储存器官，黏膜完整性遭到破坏后，不仅会造成胃肠道功能紊乱，还会导致细菌和内毒素移位，引起一系列的病理生理反应[21]。

肠上皮细胞的DAO是所有哺乳动物肠黏膜上层绒毛细胞胞浆中具有高度活性的细胞内酶。肠黏膜和外周血中DAO活性能可靠反映肠上皮细胞成熟度及完整性，其变化可反映肠黏膜屏障的功能状态[22]。肠黏膜上皮损伤时，DAO释放入血。因此，血液中DAO是反应肠黏膜上皮细胞结构完整性的敏感指标。机体可自主清除氧自由基，当产生的氧自由基与机体清除氧自由基的比例失衡，则会造成细胞损伤。SOD为机体清除氧自由基的物质，当生成的氧自由基过多，则会消耗过多的SOD，因此，血清中SOD活性能反应机体清除氧自由基的能力。MDA是脂质过氧化的产物，具有细胞毒性，血清中MDA含量代表机体氧自由基的水平，反应组织细胞的损伤程度。

番茄红素是一种属于类胡萝卜素的天然红色色素，不具有维生素A的活性，广泛存在于番茄、西柚、西瓜、葡萄、番石榴、木瓜等果实中，还广泛存在于血液、肝脏、肾上腺等人体多种器官。番茄红素在动物体内不能合成，只能从食物中摄取。Simone等[23]和 Paola等[24]的实验研究中已经证实，番茄红素通过其高效猝灭单线氧态和清除氧自由基的能力，减轻了大鼠脊髓损伤后的脂质过氧化反应，促进了其运动功能的恢复。大量的实验研究[25-27]表明，长期摄入番茄红素能降低患心血管、癌症等慢性疾病的发病率。

本研究表明，大鼠LI/R损伤能引起肠道黏膜上皮的损伤，而番茄红素高、低剂量组均能明显降低LI/R模型大鼠血清中DAO的含量，降低损伤黏膜Chiu′s评分，但番茄红素高剂量组与低剂量组损伤黏膜Chiu′s评分的能力差异无统计学意义(P>0.05)。此外，高剂量番茄红素组能明显增加LI/R模型大鼠血清中SOD活性，降低血清中MDA含量；而低剂量番茄红素组未明显增加LI/R模型大鼠血清中SOD活性。因此，高剂量番茄红素能明显提高LI/R后血清中SOD水平，抑制MDA产生，减轻氧自由基介导的脂质过氧化损伤，保护肠道黏膜上皮细胞。本实验证明，番茄红素能通过抗氧化损伤降低LI/R后肠黏膜上皮细胞的损伤，但未就番茄红素保护LI/R后肠黏膜的其他作用机制进行研究，还需要更全面深入的探究。

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A Study on Protective Effects of Lycopene Pretreatment on Intestinal Function After Limb Ischemia Reperfusion Injury in Rats

Wang Xiyan, Zhuo Rui, Song Qiang, Yang Yuefan, Wang Yi, Luo Lan, Yang Zheng△.

School of Basic Medical Sciences, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China

Objective To observe the protective effects of lycopene pretreatment on the intestinal mucosa after limb ischemia reperfusion injury and explore its mechanism. Methods 24 healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups including sham operation group (group A), model group (group B), low-dose lycopene group (group C) and high-dose lycopene group (group D), and each group consists of 6 rats. Groups C and D were pretreated with lycopene each day with the dose of 5 and 25 mg/kg respectively for 7 days in succession, while the other two groups were administrated with the equal volume of salad oil respectively. The left hind limbs of all the rats were tied with the tourniquet to induce LI/R injury in rats after 3 hours of ischemia and 18 hours of reperfusion, but the rat models of Grouop A were established without ligation. The terminal ileum was obtained to evaluate histopathological changes of intestinal mucosa by HE staining, and the blood was reserved after centrifugation and assayed to determine the activity of serum diamine oxidase (DAO) and superoxide dismutase (SOD) and the level of malondialdehyde (MDA). Results Compared with the rats in group A, the mucosal injury of the rats in Group B was significantly aggravated in light microscopic evaluations, the levels of DAO and MDA were significantly increased (P<0.01), and the activity of serum SOD was significantly decreased (P<0.05) after LI/R. In comparison with the rats in Group B, the mucosal injury of the rats in Group C reduced significantly (P<0.01), the levels of DAO and MDA decreased significantly, and the activity of SOD increased significantly (P<0.05); the mucosal injury of the rats in Group D reduced, the levels of DAO decreased significantly (P<0.01), the activity of serum SOD enhanced, and the levels of MDA decreased significantly (P<0.05). Compared with the rats in group C, the serum DAO levels of the rats in Group D decreased and the activity of MDA decreased significantly(P<0.05), while the activity of serum SOD increased and the mucosal injury reduced slightly, and the differences were not significant (P>0.05). Conclusion Lycopene can reduce the extent of intestinal mucosal damage induced by alleviating oxidative stress after limb ischemia reperfusion.

Lycopene; Limb ischemia reperfusion; Intestinal mucosa

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160728.1833.020.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.05.005

R363

A

△通信作者: 杨拯，E-mail: yzixjj@163.com