血液来源肺炎克雷伯菌耐药表型及基因型分析

肖代雯，杨永长，姜 伟，喻 华，刘 华，黄文芳

四川省医学科学院·四川省人民医院 检验科(成都 610072)



·论 著·

血液来源肺炎克雷伯菌耐药表型及基因型分析

肖代雯，杨永长，姜 伟，喻 华，刘 华，黄文芳△

四川省医学科学院·四川省人民医院 检验科(成都 610072)

目的 了解临床血液来源的肺炎克雷伯菌的耐药表型和基因型分布情况。方法 收集2014年10月至2015年10月四川省人民医院检验科临床分离的37株肺炎克雷伯菌进行耐药分析，采用双纸片扩散法检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)，PCR扩增CTX-M、TEM和SHV耐药基因, PCR产物测序确定其基因型。结果 37株肺炎克雷伯菌中产ESBLs菌株的阳性率为27.03%(10/37)。与不产ESBLs 的菌株相比，产ESBLs 的肺炎克雷伯菌对氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢曲松、头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、头孢哌酮/他唑巴坦、妥布霉素和复方新诺明的敏感性明显下降，但对亚胺培南、厄他培南、阿米卡星、头孢吡肟和哌拉西林/他唑巴坦保持较好的敏感性；大部分产ESBLs 的菌株表现出对青霉素类、头孢类和氨基糖甙类等药物的多重耐药。产ESBLs 的菌株CTX-M基因阳性率为60.00%(6/10)，3株为CTX-M-14型；TEM基因阳性率为80.00%(8/10)，均为TEM-1型；SHV基因阳性率为90.00%(9/10)，5株为SHV-11型。 结论 临床血液来源的肺炎克雷伯菌产ESBLs的阳性率较高，耐药性明显高于非产ESBLs菌株，其基因型以TEM-1型和SHV-11型为主。

血液来源；肺炎克雷伯菌；表型；基因型

肺炎克雷伯菌是一种重要的条件致病菌，可引起肺炎、尿路感染、眼内炎和败血症等疾病。据文献[1-2]统计，肺炎克雷伯菌引起血流感染的发病率位居第3位，仅次于凝固酶阴性的葡萄球菌和大肠埃希菌。随着抗生素的广泛使用，血液来源的肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的检出率不断增高，为24%～50%[1]；该菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率也呈逐年上升的趋势，从2010年9.6%～13.2%上升至2012年11.2%～19.8%[2-3]，给临床抗感染治疗带来了严峻挑战。根据质粒所携带编码基因同源性的不同，ESBLs主要分为TEM 型、SHV型、CTX-M型及一些少见的型别，如PER、VEB和GES等，但不同地区分离菌株优势β-内酰胺酶基因型有一定的差异。本研究对四川省人民医院临床血液来源的肺炎克雷伯菌进行耐药表型和基因型检测分析，了解其流行分布的规律，为临床诊治提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株来源 收集2014年10月至2015年10月四川省人民医院各科患者送检的血培养标本中， Bact/Alert 3D 120 血培养仪报阳后经全自动微生物分析仪VITEK-2鉴定的肺炎克雷伯菌37株，菌种-80 ℃保存。

1.1.2 试剂 DNA提取液购自中山大学达安基因，Taq masterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司，ESBLs CTX-M、TEM和SHV型基因特异性引物由上海英骏生物技术有限公司合成。头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟/克拉维酸和头孢他啶/克拉维酸纸购自杭州微生物试剂有限公司，Mueller-Hiton培养基购自英国OXOID公司。

1.1.3 仪器 细菌浊度仪购自法国梅里埃公司，PTC-200 全自动PCR 扩增仪购自美国Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定 采用全自动微生物分析仪VITEK-2鉴定。质控菌株包括大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.2.2 药敏试验 采用VITEK-2全自动微生物分析仪进行药敏试验，抗生素包括：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢吡肟、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、左旋氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、复方新诺明、厄他培南。

1.2.3 ESBLs的测定 按NCCLS要求，采用双纸片扩散法进行ESBLs的测定。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922(阴性对照)，肺炎克雷伯菌ATCC700603(阳性对照)。

1.2.4 DNA提取 挑取MAC培养基上经过分离培养的菌落，加入DNA提取液100 μL，混匀，煮沸10 min，冷却后10 000 r/min，离心10 min，取上清备用。

1.2.5 PCR扩增 根据参考文献[4]合成引物 CTX-M/F: 5′-GTTACAGCCCTTCGGCGATGA TTC-3′, CTXM/R: 5′-GCGCATGGTGACAAAG AGAGTGCA- 3′,TEM/F:5′-TCGGGGAAATG TGCG-3′ TEM/R: 5′-TGCTTAATCAGTGAGG CACC-3′ SHV/F: 5′ -GCCGGGTTATTTTATTT GTCGC- 3′ SHV/R:5′-TCTTTCCGATGCCGCC GCCAGTCA-3′。扩增长度分别为CTX-M 877 bp，TEM 972 bp，SHV 1 015 bp。反应体系(20 μL)为10 μL Taq masterMix, 1 μL上下游引物, 1 μL DNA模板。PCR反应条件为：94 ℃ 3 min; 94 ℃ 1 min, CTX-M 55 ℃ 1 min(SHV 68 ℃, TEM 55 ℃), 72 ℃ 1 min, 30 cycles, 72 ℃ 10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后Bio-Rad凝胶成像仪检测。阳性的PCR扩增产物送测序，结果与Genebank数据库比对分析后确定其基因型。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，药敏结果采用例数(%)描述，不同菌株的耐药性比较采用2检验或Fisher确切概率法。检验水准α设定为0.05。

2 结果

2.1 药敏试验

37株肺炎克雷伯菌产ESBLs阳性率为27.03%(10/37)。与不产ESBLs 菌株相比，产ESBLs 的肺炎克雷伯菌菌株对氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢曲松、头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、头孢哌酮/他唑巴坦、妥布霉素和复方新诺明的敏感性明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而阿米卡星、头孢吡肟和哌拉西林/他唑巴坦对产ESBLs 菌株具有较好的抗菌活性。37株菌对氨苄西林全部耐药，但未发现对亚胺培南和厄他培南耐药的株菌(表1)。

2.2 PCR扩增

用特异性引物扩增10株产ESBLs肺炎克雷伯菌，其扩增片段大小与预期相符(图1)。其中6株CTX-M基因阳性，8株TEM基因阳性，9株SHV基因阳性。有6株菌同时携带CTX-M、TEM和SHV基因，有1株同时携带TEM和SHV基因(表2)。

表1 血液来源肺炎克雷伯菌耐药性分析

图1 部分产ESBLs肺炎克雷伯菌耐药基因扩增电泳图

注：M: marker； 1: TEM-44； 2:TEM-93； 3:CTX-44； 4:CTX-93； 5:SHV-44

表2 产ESBLs菌株耐药基因扩增及测序结果

2.3 PCR产物测序

经测序证明，6株CTX-M基因阳性扩增产物中，3株为CTX-M-14型，1株为CTX-M-3型，8株TEM基因阳性扩增产物均为TEM-1型，9株SHV基因阳性扩增产物中5株为SHV-11型，2株为SHV-1型(表2)。

3 讨论

近年来，随着免疫抑制剂及大型有创操作的广泛应用，血流感染的发病率不断上升。肺炎克雷伯菌是血培养最常分离到的革兰阴性杆菌之一，据统计，由肺炎克雷伯菌引起血流感染的发病率占血流感染总数的6%～9%[1-2]。随着抗生素的广泛使用，肺炎克雷伯菌耐药问题日益严重，ESBLs及对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的阳性检出率呈上升趋势。本研究所收集的37株血液来源的肺炎克雷伯菌，其中产ESBLs菌株阳性率为27.03%(10/37)。 ESBLs多在β-内酰胺类抗生素的选择压力下诱导产生，能水解包括第三代头孢菌素、单环酰胺类抗生素和第四代头孢菌素等含1个氧亚氨基基团侧链的β-内酰胺类抗生素。本研究中10株产ESBLs菌株耐药性明显高于不产ESBLs菌株，对氨苄西林和呋喃妥因的耐药率为100.00%(10/10)，对氨苄西林/舒巴坦、头孢曲松和复方新诺明的耐药率为90.00%(9/10)，且大部分表现出对青霉素类、头孢类和氨基糖甙类等药物的多重耐药，这可能与这几类药物的临床广泛运用有关，应引起临床工作者的高度重视。目前，四川省人民医院血液来源的产ESBLs肺炎克雷伯菌对第四代头孢菌素如头孢吡肟、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦及碳青霉烯类抗生素保持了较好的抗菌活性(>90.00%)，可作为产ESBLs 肺炎克雷伯菌治疗的首选药物。

不同国家、地区由于使用抗生素的种类和数量不同，ESBLs的流行株也各有差异，其基因型各不相同。如美国纽约和突尼斯以CTX-M-15型为主[5-6]，台湾地区主要流行SHV型[7]，广东地区以CTX-M型为主，山西地区以TEM型常见[8-9]。本研究发现，6株CTX-M阳性菌株中，3株为CTX-M-14型，其特征是该基因型产生的ESBLs对头孢噻肟和头孢曲松的水解力较强，而对头孢他啶的水解能力相对较弱。8株TEM阳性菌株全为TEM-1型，对头孢他啶的水解能力较强。SHV型ESBLs耐药基因主要存在于克雷伯菌属中,其特点是能水解头孢噻肟和头孢他啶。本研究中SHV阳性菌株有9株，5株为SHV-11型。7株菌同时携带了2种以上耐药基因，其中2株为CTX-M-14+TEM-1+SHV-11模式。

综上所述，抗生素的广泛应用导致细菌的耐药性呈现出高水平、多重耐药和交叉耐药的趋势。加强细菌耐药的监测，对疾病的预防和指导临床合理选用抗菌药物具有十分重要的意义。

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Analysis of the Drug-resistant Phenotype and Genotype of Klebsiella Pneumonia Isolated from Blood

Xiao Daiwen, Yang Yongchang, Jiang Wei, Yu Hua, Liu Hua, Huang Wenfang△.

Clinical Laboratory Department, Sichuan Academy of Medical Science & Sichuan Provincial People′s Hospital, Chengdu 610072, China

Objective To investigate the drug-resistant phenotype and genotype of Klebsiella pneumonia strains isolated from blood. Methods Drug resistance of 37 Klebsiella pneumonia strains isolated from October of 2014 to October of 2015 in Sichuan Provincial People′s Hospital was analyzed. Extended-Spectrum β-Lactamases (ESBLs) producing strains were confirmed by double disk diffusion test. The drug resistant genes of CTX-M, TEM, SHV were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and the amplified products were sequenced to identify the genotype. Results The positive rate of ESBLs-producing Klebsiella pneumonia was 27.03%(10/37). The drug resistance of ESBLs-producing strains to ampicillin/sulbactam, aztreonam, ceftraxone, ceftazidime, ciprofloxacin, gentamicin, levofloxacin, cefoperazone/tazobatam, tobramycin and selectrin was much higher than ESBLs-negative ones, but ESBLs-producing isolates showed good susceptibility to imipenem, ertapenem, amikacin, cefepime and piperacillin/tazobactam sodium. Most of ESBLs-producing strains were multi-resistant to penicillins, cephalosporin and aminoglycoside antibiotics. The drug-resistance genes of CTX-M, TEM, SHV were found in 60.00%，80.00% and 90.00% ESBLs-producing strains respectively. The results of sequencing showed that 3 strains of 6 CTX-M were identified as CTX-M-14, 8 strains of TEM as TEM-1 and 5 strains of SHV as SHV-11. Conclusion The prevalence of ESBLs-producing Klebsiella pneumonia is high and the drug-resistance of ESBLs-positive isolates is significantly better than that of ESBLs-negative ones. The dominating genotyes of ESBLs are TEM-1 and SHV-11.

Isolated from blood; Klebsiella pneumonia; Phenotype; Genotype

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.05.012

R446.5

A

△通信作者：黄文芳， E-mail： huangwf2002@21cn.com