β-catenin在铜绿假单胞菌角膜炎中的调控研究*

傅 强，陈 康，黄福达，缪丽韶，杨山虹，张秀明

(广东省中山大学附属中山医院检验医学中心 528403)



·论 著·

β-catenin在铜绿假单胞菌角膜炎中的调控研究*

傅 强，陈 康，黄福达，缪丽韶，杨山虹，张秀明△

(广东省中山大学附属中山医院检验医学中心 528403)

目的 探讨β-catenin在铜绿假单胞菌角膜炎中发挥的作用及其调控机制。方法 Western-blot检测β-catenin慢病毒应用的效果，临床评分观察疾病进展；Real-time 聚合酶链式反应(PCR)检测炎性因子和抗菌肽的表达；平板细菌计数检测角膜细菌清除情况。结果 β-catenin延缓角膜炎的疾病进展；随后实验发现β-catenin抑制促炎因子的分泌，并上调抗菌肽CRAMP表达，促进细菌清除。结论 β-catenin通过调节炎性反应并促进细菌清除，在铜绿假单胞菌角膜炎中发挥角膜保护作用。

β-catenin； 角膜炎； 炎性反应； 细菌清除

铜绿假单胞菌(PA)是革兰阴性条件致病菌，当角膜发生损伤时易感染角膜诱发角膜炎，其致病机制是过度炎性反应和细菌侵袭导致的角膜病理损伤[1-2]。因此，如何抑制过度炎性反应并清除角膜细菌是治疗疾病的关键。β-catenin是经典Wnt通路中核心分子，调节细胞的凋亡、增殖、肿瘤形成等，参与机体众多生理和病理过程[3]。作为1个多功能分子，β-catenin可以参与调节细菌的定植和机体的炎性反应[4-5]。研究报道β-catenin可在沙门菌感染和结核分枝杆菌感染时抑制炎性反应[4-5]，并抑制细菌定植，然而其在PA感染中的作用尚属未知。本研究构建PA角膜炎的动物模型，观察β-catenin对该疾病的调节作用及机制。研究发现，β-catenin通过抑制促炎因子的分泌，促进细菌清除，延缓角膜炎疾病进展，在PA角膜炎中发挥角膜保护作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 用乙醚麻醉小鼠后，在体视显微镜40倍放大倍数下用25 G的针头在小鼠的左侧眼角膜上连续划3下，每次划痕约1 mm。用移液器滴加入5 μL的1×106CFU/mL菌量于划伤角膜，右侧眼未经任何处理作为正常对照。感染PA的小鼠角膜于1、3、5 d观察角膜病变情况。根据已建立的角膜疾病临床分级评分如下：0级，角膜清澈或轻度浑浊，浑浊范围部分或完全遮盖瞳孔；+1级，角膜轻度浑浊，浑浊范围部分或完全遮盖眼前段；+2级，角膜浑浊度增高，浑浊范围部分或完全遮盖眼前段；+3级，角膜高度浑浊，浑浊范围完全遮盖眼前段；+4级，角膜穿孔。感染后5 d，裂隙灯显微镜观察并拍摄细菌感染后小鼠角膜的炎性状态，用临床评分法确定角膜疾病的严重程度。

1.2 方法

1.2.1 Western-blot 结膜下注射β-catenin慢病毒β-catenin lentivirus、β-cat-lentivirus及对照慢病毒control lentivirus、Ctl-lentivirus，收集角膜的蛋白样品，经十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后转膜至硝酸纤维膜上，分别孵育5%脱脂奶粉、β-catenin(1∶1 000)的一抗、抗兔二抗。经曝光后检测目的蛋白的量。

1.2.2 Real-time聚合酶链式反应(PCR) 用TRIzol法提取细胞RNA。1 g RNA 转录成cDNA，用SYBR Green进行Real-time PCR扩增。白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-β、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-2、抗菌肽(如CRAMP、β-defensin 1～3、mBD 1～3)和β-actin的引物序列，见表1。

1.2.3 角膜活细菌平板计数 于感染后5 d收集β-catenin慢病毒注射组和对照组的小鼠角膜，用含有0.85%(w/v)NaCl和0.25%牛血清清蛋白(BSA)的无菌水碾磨，10倍系列稀释样品，涂布于PA分离平板，37 ℃孵箱培养过夜，每个稀释度设3个复板，第2天计数平板菌落。

表1 引物列表

2 结 果

2.1 结膜下注射慢病毒的效果 为了研究β-catenin在PA角膜炎中的调控作用，结膜下注射β-catenin慢病毒或对照慢病毒，Western-blot显示，PA感染小鼠角膜后，β-catenin的表达低于正常角膜，结膜下注射β-catenin慢病毒后，β-catenin的表达水平显著上调。见图1。

注：泳道1为正常对照；泳道2为对照慢病毒+PA；泳道3为β-catenin慢病毒+PA。图1A为结膜下注射β-catenin慢病毒的效果图；图1B为β-catenin相对于β-actin 的灰度扫描结果。数据源于3次独立实验，每次实验5只小鼠角膜。**P<0.05。

2.2 β-catenin延缓角膜炎疾病进展 临床评分结果显示，在PA感染后1、3、5 d，β-catenin慢病毒注射组疾病的严重程度减轻，1、3、5 d的临床评分分别为+1、+2、+3，而对照组的临床评分分别为+2、+3、+4。裂隙灯显微镜照片显示，β-catenin慢病毒注射组角膜中/重度浑浊遮盖瞳孔区；对照组膜溃疡穿孔。临床表现结果提示β-catenin能够延缓PA角膜炎的疾病进程，在PA角膜炎中发挥角膜保护作用。见图2。

注：图2A为临床评分显示β-catenin慢病毒注射组在小鼠感染后1、3、5 d临床评分均低于对照组(P<0.05)，**P<0.05，***P<0.05，横线表示中位线评分；图2B为对照组感染后5 d的小鼠角膜照片；图2C为β-catenin慢病毒注射组感染后5 d的小鼠角膜照片。数据源于3次独立实验，每次实验5只小鼠角膜。

2.3 β-catenin抑制促炎因子的分泌 炎性因子的分泌是引起角膜过度炎性反应的关键因素。为全面了解角膜的炎性反应情况，笔者检测β-catenin慢病毒注射组和对照组促炎因子的表达。结果显示，在PA感染后5 d，β-catenin抑制促炎因子IL-1β、TNF-α和MIP-2的表达，而对IL-6的表达无影响。在未感染时，2组的炎性因子分泌无差别。见图3。

注：图3A为Real-time PCR检测β-catenin慢病毒注射组和对照组感染角膜炎性因子IL-6的表达；图3B为IL-1β的表达；图3C为TNF-β的表达；图3D为MIP-2的表达。数据源于3次独立实验，每次实验5只小鼠角膜。*P<0.05；**P<0.05；***P<0.05。

2.4 β-catenin促进角膜细菌的清除 除了过度炎性反应，细菌侵袭也是导致角膜炎病理损伤的主要因素。平板计数结果发现，PA感染后5 d，与对照组比较，β-catenin慢病毒注射组的角膜荷菌量显著降低，提示β-catenin促进细菌清除。为了探讨β-catenin促进细菌清除的机制，笔者检测了抗菌肽的表达。实验结果发现，β-catenin促进抗菌肽CRAMP的表达，而对抗菌肽mBD 1～3的表达无影响。见图4。

注：图4A为平板细菌计数检测β-catenin慢病毒注射组和对照组的角膜荷菌量；图4B为Real-time PCR的方法检测抗菌肽CRAMP的表达；图4C为mBD 1～3的表达。数据源于3次独立实验，每次实验5只小鼠角膜。**P<0.05。

3 讨 论

β-catenin是一个多功能分子，参与众多生理和病理过程，并可参与调节炎性反应和细菌的定植。研究报道，在沙门菌感染和结核分枝杆菌感染时[4-5]，β-catenin有利于感染性疾病的恢复，然而其在PA感染中的作用尚未知。本研究发现，β-catenin通过抑制促炎因子的分泌并促进角膜细菌的清除，延缓角膜炎的疾病进展，发挥角膜保护作用。

据报道，在不同疾病中，β-catenin对机体炎性反应的调节作用不同。β-catenin可在沙门菌感染和结核分枝杆菌感染时抑制炎性反应[4-5]；然而，也有报道β-catenin可诱导多种炎性介质如一氧化氮、IL-8、环氧合酶、前列腺素E2的表达，促进机体炎性反应[6-8]。本研究发现，在PA感染角膜时，β-catenin通过抑制促炎因子的分泌发挥抑炎作用。

除了机体过度炎性反应，角膜细菌侵袭也是导致角膜炎病理损伤的重要因素。本研究发现，β-catenin可促进角膜细菌的清除，抗菌肽CRAMP和抗菌肽mBD可通过降低角膜荷菌量并抑制角膜炎性反应[9-12]，延缓角膜炎疾病进展。β-catenin可促进抗菌肽CRAMP的表达，对抗菌肽mBD 1～3的表达无影响，提示β-catenin通过上调抗菌肽CRAMP的表达，促进角膜细菌的清除。

综上所述，本研究揭示了β-catenin在PA角膜炎中的调节作用，为角膜炎疾病的临床辅助应用提供了坚实的理论基础。

[1]Hazlett LD.Corneal response to pseudomonas aeruginosa infection[J].Prog Retin Eye Res,2004,23(1):1-30.

[2]Hazlett LD.Pathogenic mechanisms of P.aeruginosa keratitis:a review of the role of T cells,Langerhans cells,PMN,and cytokines[J].DNA Cell Biol,2002,21(5/6):383-390.

[3]Wodarz A,Nusse R.Mechanisms of Wnt signaling in development[J].Annu Rev Cell Dev Biol,1998,14(1):59-88.

[4]Duan Y,Liao AP,Kuppireddi S,et al.Beta-catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation[J].Lab Invest,2007,87(6):613-624.

[5]Schaale K,Neumann J,Schneider D,et al.Wnt signaling in macrophages:augmenting and inhibiting mycobacteria-induced inflammatory responses[J].Eur J Cell Biol,2011,90(6/7):553-559.

[6]Du Q,Park KS,Guo Z,et al.Regulation of human nitric oxide synthase 2 expression by Wnt beta-catenin signaling[J].Cancer Res,2006,66(14):7024-7031.

[7]Masckauchán TN,Shawber CJ,Funahashi Y,et al.Wnt/beta-catenin signaling induces proliferation,survival and interleukin-8 in human endothelial cells[J].Angiogenesis,2005,8(1):43-51.

[8]Haertelwiesmann M,Liang YX,Fantl WJ,et al.Regulation of cyclooxygenase-2 and periostin by Wnt-3 in mouse mammary epithelial cells[J].J Biol Chem,2000,275(41):32046-32051.

[9]Huang LC,Reins RY,Gallo RL,et al.Cathelicidin-deficient(Cnlp-/-) mice show increased susceptibility to pseudomonas aeruginosa keratitis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48(10):4498-4508.

[10]Kumar AD,Yu FS.Flagellin suppresses the inflammatory response and enhances bacterial clearance in a murine model of pseudomonas aeruginosa keratitis[J].Infect Immun,2008,76(1):89-96.

[11]Augustin DK,Heimer SR,Tam C,et al.Role of defensins in corneal epithelial barrier function against pseudomonas aeruginosa traversal[J].Infect Immun,2011,79(2):595-605.

[12]Wu M,Mcclellan SA,Barrett RP,et al.Beta-defensins 2 and 3 together promote resistance to pseudomonas aeruginosa keratitis[J].J Immunol,2009,183(12):8054-8060.

Study on regulatory role of β-catenin in Pseudomonas aeruginosa keratitis*

FUQiang,CHENKang,HUANGFuda,MIAOLishao,YANGShanhong,ZHANGXiuming△

(LaboratoryMedicineCenter,AffiliatedZhongshanHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan,Guangdong528403,China)

Objective To explore the role of β-catenin in Pseudomonas aeruginosa(PA) keratitis and its regulatory mechanism.Methods Western-blot assay was used to detect the efficacy of β-catenin lentivirus application.The clinical score was used to observe the disease progression;the expression of inflammatory cytokines and antimicrobial peptides were examined by using real-time PCR;the corneal bacterial clearance was detected by using the plate bacterial count.Results β-catenin delayed the progression of keratitis;then the following experiment found that β-catenin suppressed the secretion of pro-inflammatory cytokines,up-regulated the antibacterial peptide cathelicidin-related antimicrobial peptide(CRAMP) expression and promoted the bacterial clearance.Conclusion β-catenin plays the corneal protective effect in PA keratitis by regulating inflammatory reactions and promoting the bacterial clearance.

β-catenin; keratitis; inflammation; bacterial clearance

国家自然科学基金青年基金资助项目(81401645)；广东省医学科研基金资助项目(B2014447)；广东省中山市科技计划项目(2014A1FC098)；广东省中山市医疗科研项目(2015J004)。

傅强，男，主管技师，主要从事临床检验诊断方面的研究。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.0 01

A

1673-4130(2016)22-3093-03

2016-04-05

2016-06-11)