人芽囊原虫形态学的研究进展

韩呈武 综述，曹兴午 审校

(中日友好医院检验科，北京 100029)



·综 述·

人芽囊原虫形态学的研究进展

韩呈武 综述，曹兴午△审校

(中日友好医院检验科，北京 100029)

人芽囊原虫； 形态学鉴定； 培养； 寄生虫

人芽囊原虫(B.h.)是一种常见的人与动物肠道寄生虫。于1849年首次报告，1912年从人体粪便中发现，根据其形态特征归属于酵母菌，并命名为人体酵母菌，其后，在哺乳类、鸟类、爬虫类、两栖类及昆虫类都得到检出。B.h.一直被认为是一种对人体无害的酵母菌，1976年有学者进一步对形态特征进行了光镜与电镜区别。根据其性质、生理和形态体征发现，B.h.严格厌氧，采用培养细菌或真菌的培养基不能生长，营养类似原虫，室温培养3 d死亡，pH 7环境生长，无细胞壁，具有伪足和原虫线粒体等特点[1]。1996年以后进行分子生物学的研究，人体分离虫株间的遗传性显示了多形态特点。目前，确定B.h.分为9个遗传子类型，另在鸟类、哺乳类同样亦可检出，确定其为人畜共患病原菌[2]。为提高B.h.检出率，本研究重点就B.h.形态学鉴定、方法与B.h.病进行综述。

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1 流行病学与检出率

B.h.世界均有报告，高发于热带和亚热带地区[3]。广西省地处亚热带，气候温暖潮湿，是多种寄生虫病流行的重要地区。近年研究表明，B.h.感染在广西人群中较常见[4-5]。但是，临床医师对恶性肿瘤患者B.h.感染认识不足，易漏诊或误诊，导致恶性肿瘤患者的病情加重[6]。

吉川尚男[2]认为：由于检查方法不同(如直接镜检、染色检查、培养检查)，检查对象和鉴定水平存在差异，各地区检出率差异性较大。美国为22.9%，英国为6.9%(96/1 390)，日本采用粪便碘染色镜检+直接涂片检查+姬姆萨染色检查阳性率为0.47%(30/6 422)。其采用培养方法，提高阳性率为2.45%(50/2 037)，并强调反复多次检查慢性腹泻的患者粪便检出率高。张峰等[7]介绍，我国有几十个省市报道有B.h.感染。

笔者注意到20世纪70～90年代一直以B.h.无致病性处理。在日常粪便常规寄生虫检查中，以铁苏木素染色，油镜观察，检出率为45.0%，曾强调腹泻患者更为多见[8]，并指出一般镜检容易与白细胞混淆[9]。

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长期以来，B.h.生活史尚不清楚，造成对其形态和致病性不明确。近期研究认为，B.h.通过3种方式进行发育与繁殖：颗粒型方式、空泡型方式、阿米巴型方式。见图1。如何使滋养体形成空泡型，颗粒型营二分裂繁殖及形成包囊型，至今不明[2]。 可从宿主粪便培养中看到，包囊型分化成空泡型与颗粒型。由于作为具有感染性质的包囊型在人体盲肠和大肠内形成与寄居，人工培养不能造成肠道微环境，故在培养基中看不到包囊型。包囊随着粪便排出外界后，经口食入感染，在人体肠腔内脱囊，才能形成空泡型与颗粒型B.h.，而后，其再进行分裂、繁殖和增生，完成生活史[2]。因此，包囊型发育成为空泡型与颗粒型只有在宿主肠道内才可看到，体外人工培养不可能完成包囊型B.h.[2]。

2 生活史

全国人体重点寄生虫病现状调查SWOT分析(2015)认为[11]：寄生于人体且致病的肠道原虫常见有溶组织内阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫和B.h.等，上述寄生虫是引起人体腹泻、腹痛的主要病原体。目前，B.h.在全世界依然被列为威胁人类健康的10种主要寄生虫病之一，其感染潜在危害较大，且易与一般胃肠道感染相混淆，容易漏诊或误诊，严重时可危及生命[11]。

培养基制作：用1 mol/L的NaOH调整蒸馏水pH 7.0～7.4，加至1 000 mL。放置120 ℃，高压灭菌20 min，灭菌后备用，放入冰箱可保存一年以上。加入无菌马血清，制作成液体培养基，放入冰箱可保存1个月以上。此外，可分装在5～15 mL塑料管中灭菌后备用。培养基装入培养容器70%容量即可。

近年胡缨等[10]对就诊的 1 185 例慢性腹泻患者进行粪便检查，B.h.感染率为12.24%，其中有黏液脓血便患者感染率显著高于其他类型腹泻者(P<0.05)；不同性别、年龄腹泻者间感染率差异无统计学意义(P>0.05)；农民感染率最高(为20.29%)。实验室辅助检查中，69.66%的感染患者中有血红蛋白降低；80.69%的感染患者IgG、IgM、IgA均正常；86.90%的感染者 CD3+、CD4+表达水平降低，CD8+表达水平相对稳定，CD4+/CD8+比值下降。 结论认为，B.h.感染是慢性腹泻的1个重要病原体，其致病作用不容忽视。

注：空泡型见于生活史的底部(通常在临床标本中可以看到)；颗粒型的发育见于生活史图的左侧部分；阿米巴型见于生活史图的右侧部分。颗粒型与阿米巴型的虫体均可以由空泡型(中心体)产生而来;增殖可通过二分裂(空泡型和颗粒型)、出芽(形成阿米巴型)、裂体生殖(中心体)和孢子形成(空泡型，少见)而发生。

3 形态学特征描述

染色液配制：90%乙醇170 mL；100%甲醇160 mL；醋酸20 mL；石炭酸20 mL；1%磷钨酸12 mL。将上述试剂注入618 mL的蒸馏水中，混合均匀，加入氯碳混合剂(武藤化学和光纯药工业产品)5 g，混合后备用。

用染色序列对P进行着色,实际上是对m(2n+1)+2n-1条边进行着色,而图4中色集合的个数有个,根据上述染色算法,当k是奇数时,有当k是偶数时,有因此恒成立,此时求得最小的整数k满足⎤。

注：中央有巨大空泡，核紧靠边缘。

注：细胞呈泡状结构，内含大量大小不一、功能不详的颗粒，核靠近边缘。

注：形态不规则，有伪足、核边缘化，中央有空泡和颗粒。

4 显微镜不同倍率检查与形态特征

4.1 低倍镜检查 笔者采用生理盐水直接粪便涂片低倍显微镜观察，B.h.为无色或浅黄色，圆形或卵圆形，大小不一，数量多时视野可呈“满天星”点状。内含1个巨大透明体，其周围围绕以极小细胞质，在细胞质内可看到有少数折光小体(颗粒)，遇到普通水或蒸馏水可以迅速破裂而消失[9]，见图5(仅见虫图轮廓)。

图5 患者粪便标本低倍观察

4.2 高倍镜检查 在光镜下(40×10)，生理盐水涂片中B.h.为圆形、卵圆形，无运动现象，核及其他结构不易辩认，不易与其他肠道原虫包囊区别；可见3类型：空泡型、颗粒型和阿米巴型。新鲜粪便标本立即涂片可观察到直径为5～50 μm的空泡型和颗粒型虫体，见图6。此外，还可检出直径为3～5 μm的包囊型虫体，通常小型虫体光镜观察比较困难。

注：培养的虫体在中央均有液泡(CV)。具有圆形小颗粒为颗粒型(GF)；无颗粒者为空泡型(VF)[2]。

排出粪便后，放置4 h再进行粪便涂片时，空泡型与颗粒型虫体不能维持原来形态，此为B.h.严格厌氧性质决定。虫体排出后接触空气，会发生急剧变性和裂解，见图7。变性的空泡型与颗粒型虫体与原本不固定的阿米巴型虫体很难区分。从粪便标本中检出特殊的阿米巴型就比较困难[2]。

注：在盖玻片周围的虫体，由于接触空气(氧气)导致虫体裂解，呈形态空化、溶解(A)。再延时后，可以完全变性，细胞膜呈纤维状，其中央呈颗粒聚焦现象(B)[2]，完全溶解。

培养基放置冰箱冷藏，接种标本时，必须将培养基置于室温事先预热，将新鲜粪便培养放入培养基，用灭菌棒搅拌均匀。与放入粪便量有关，一般采用15 mL的塑料管，放入1 g粪便较适宜。如果采用微型管，一般在5～10 mg(3倍火柴头大小)为宜。

4.3 油镜检查 B.h.低、高倍率显微镜颗粒型，不易与肠道内较小原虫、哈门内阿米巴、脆弱双核阿米巴等区别。用铁苏木素染色光镜(100×10)观察,B.h.形态多样，可见空泡型、颗粒型、阿米巴型及二分裂型[1]。其中以空泡型多见,虫体显示出显著囊壁，中央有清楚和染色较深的区域将核推向虫体边缘，核染成深蓝色，多在3个以上[13]。见图8、9。

图8 铁苏木素染色光镜(100×10)观察B.h.空泡型，核边缘化[13]

图9 铁苏木素染色光镜(100×10)观察B.h.空泡型，核边缘化[12]

4.4 瑞姬方法染色 空泡型虫体，形态多样化，中央空化，核边缘化。见图10。

图10 瑞姬方法染色空泡型虫体

4.5 电镜观察 何妮等[1]介绍：B.h.电镜观察可根据包囊有无纤维外衣将其分为纤维包囊型和包囊型2种。纤维包囊型能吸附细菌和其他包囊，导致异体宿主感染。2种包囊型内部结构大体相同。B.h.浆内含有粗面和滑面内质网、高尔基体、溶酶体、糖原颗粒等，细胞核内有异染色体，线粒体差异变化大，细胞膜有微吞饮功能，细胞外可能包被纤维外衣。在培养中发现，B.h.包囊形成过程中蛋白代谢增强，细胞核周围及粗面内质网区域管沟样机构增加[1]。

5 采用不同检查方法与形态特征

对B.h.而言，检查方法与检出率密切相关，不同的染色方法有不同形态特征，学者曾进行的不同尝试与经验，现分别介绍如下。

5.1 碘染色方法 此为鉴定粪便阿米巴包囊经常采用的方法，取一滴碘液在载物片上，用牙签采取粪便少许，涂成薄片，加盖盖玻片镜检，低倍镜可以看到B.h.呈耀眼亮点，高倍镜可看到B.h.当中的空泡，此可与其他包囊鉴别，见图11。如果虫体较少、粪便标本排出时间过长或标本保存不好就难以检出[2]。

注：A为结肠阿米巴包囊(下面)和多态性B.h.的颗粒型虫体(上面)。B为可看到二分裂虫体的标本。无论哪一种虫体，都可以染成黄色，在细胞质周围可见颗粒状的线粒体样物质和细胞核(B.h.)特征[2]。

5.2 Cone染色液方法[2]本方法优点为直接检查与固定标本同时进行。将粪便标本涂成薄片，在涂片标本处于半干状态，滴加染色液(见配方)，染色30 min，用蒸馏水轻轻冲洗，加盖片镜检。染色适宜度为酵母菌等浓染。B.h.呈深蓝色或黑色，此为染色液特异性的结果，见图12a。镜检发现染色不理想时，仍然可重新再染1次。如果想永久保存标本，可采取蒸馏水冲洗后干燥，或用乙醇梯度脱水，用二甲苯透明后，再用光学树脂封片。在此染色片中，油镜下可看到虫体周围有一圈空白区(此为B.h.周围1层纤维状结构不被染色而形成的空白区)，这可与其他原虫进行鉴别[2]，见图12b。

吉川尚男[2]报告，目前共识有3类型B.h.：空泡型、颗粒型和阿米巴型。空泡型与颗粒型的不同之处在于虫体中心部位有无液泡，空泡型虫体内所呈液泡为无构造和类似细胞液泡样的均匀物质，而颗粒型则可以看到虫体中心部位有颗粒样物质存在，此为区别两者依据[2]。见图2、3。阿米巴型最显著特点为形态不规则，见图4。其有伪足和伪足运动，但运动相当缓慢，细胞核内含有空泡和颗粒[1]。颗粒型虫体也能以二分裂方式繁殖[13]。何妮等[1]描述，空泡型直径3～64 μm，大小差异悬殊，折光性强，虫体透明，活体时细胞核不可见，细胞内有1个极大空泡结构。1990年研究报告B.h.还存在包囊型，直径为2～5 μm，囊壁厚。不同来源的宿主其包囊形态不同。

注：A为B.h.浓染时呈深蓝色甚至黑色，但看不到内部构造；B为浅染色时，可以看到中央的空泡和颗粒状的细胞质，在虫体周围呈1个轮廓的“空圈”，可为鉴别特征。

5.3 MIF固定染色方法 适用于粪便中原虫及蠕虫虫卵的固定、染色和标本保存，原虫与虫卵标本可长期保存。但B.h.不期望长期保存，只是短时间尽可能将标本处理，仅存留一部分标本作为长期保存备以后使用。使用甲醛固定的标本不能保持其原来的圆形形态，空泡型与颗粒型会形成多种多样形态，见图13。

注：B.h.形态不固定，中央空泡染色不均匀，在周围细胞质内有线粒体样结构和核，此点为鉴定特征[2，14]。

5.4 培养方法[2]以下介绍的方法为简单且检出率高的方法，之后还可进行遗传学检查，特别适用于DNA测定，很有实用价值。虽然已经报道多种培养基方法，但以液体培养基更为简单方便。液体培养基组成：氯化钠8.5 g；氯化钙0.33 g；氯化钾0.3 g；天门冬酰胺0.5 g。

大姐来淮南办事，晚上在我家睡一觉，隔天早上回合肥。妻子问大姐，你先看电视，还是先洗澡？大姐跑一天，显出一副疲倦的样子。大姐说，我先歇一歇。我家住两室一厅，我和妻子睡大卧室，摆一张大床，摆一组大柜；闺女睡小卧室，摆一张小床，摆一排书柜，书房兼卧室。大姐在我家过夜，她和妻子睡卧室大床，我睡客厅沙发上。妻子说她小时候就是跟大姐睡一张床，直到大姐下放去农村。妻子和大姐一边看电视一边说闲话，一说就说到皮肤病上面。大姐说，我劝你还是早一天去省立医院看。妻子说，好、好、好，哪一天我休班就去你家。两集电视剧看下来，时间到十点多钟。妻子去卧室拿铺盖，准备在沙发上为我临时铺一张床。

空泡型与颗粒型不同点在于依细胞中心位置的液泡，空泡型呈均匀无结构，颗粒型则具有细小颗粒物质。在高倍光镜下仅从中央液泡就可区分两者形态差异，但电镜观察并不显著[2]。

放入37 ℃温箱培养，2～5 d，每天以灭菌吸管，吸取管底沉淀物表面，放载物片，盖上盖玻片，在显微镜下进行观察。可见B.h.繁殖的虫体。见图14、15。由于粪便内细菌繁殖，培养管内产生压力，培养管可能发生自然脱落现象。当培养管盖脱落时，内容物可能喷出，污染温箱或环境。另外，培养虫体在2 d急剧繁殖，消耗营养多，需要在次日转种1次新培养基，保持继代培养。培养基中渣滓较少时，进行DNA提取为宜[2]。

本文以《明史》中的《宰辅 年表》［2］（卷109、110，宰辅年表一、二）为主要研究对象。注意到其中存在错误，学界已有人进行了订正，例如胡丹的《〈明史·宰辅年表〉校正〉》［3］。本研究结合《明史》中的其他内容及《明实录》等进行了校勘。

注：可以看到呈圆形大小不等的虫体，也可观察到多形态的阿米巴型虫体[2]。

注：能清楚看到多核虫体，2个核的端极都以对角线形式存在，形成“双眼”状态[2]。

5.5 3种方法联合检查观察 该方法为阿米巴原虫经典染色方法[7]，众多教科书的阿米巴原虫图谱大都依此法染色。1948～1963年，笔者在协和医院寄生虫室对粪便寄生虫常规的检查中，每例患者标本均采用粪便直接涂片、碘染色、硫酸锌漂浮法3种方法联合显微镜检查，凡遇到原虫且即便是可疑时，必须进行铁苏木素染色方法制作标本，经油镜检查与鉴定[15-16]，共完成115 834例寄生虫感染患者的检查与统计[17]，并获得B.h.检出率45%的统计结果[9]。可见所用检查方法决定检出率高低。

6 临床表现

B.h.是近20 年来被人们所重视与腹泻相关的人体寄生虫，其症状无特殊表现，易与肠道一般感染相混淆。一旦粪便检出B.h.即可确诊。对于部分慢性腹泻而病因不明的患者应注意该虫感染的可能[10]。脓血便原因分析可能是红细胞能为B.h.提供营养物质，故而B.h.感染更易存在于黏液脓血便中；再者慢性腹泻治疗不当易引起肠黏膜损伤和肠道功能紊乱，甚至出现黏液脓血便，上述情况下B.h.更容易侵入机体。

胡缨等[6]报道，在对683例恶性肿瘤住院患者进行B.h.病原学检查中发现，受感染者112例(16.40%)，其中黏液脓血便组感染率显著高于其他类型粪便组(P<0.05)；不同性别、年龄间感染率差异无统计学意义(P>0.05)；在不同治疗组中，化疗组感染率最高，为26.40%；在不同肿瘤类别组中，消化系统组的感染率最高，为28.51%；低清蛋白组感染率显著高于清蛋白健康组(P<0.05)；免疫功能低下组感染率显著高于免疫功能健康组(P<0.05)。B.h.大量繁殖导致感染者不同程度的肠道病变，其临床表现无特异性；大部分感染者主要表现为腹痛、腹泻、腹胀、厌食、恶心、呕吐等症状；部分感染者可出现乏力、发热、全身不适等，易与一般炎性反应相混淆；个别重症患者可导致严重腹泻、低蛋白血症、全身水肿等，甚至危及生命[18-19]。

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7 治 疗

治疗本病多采用甲硝唑(灭敌灵)，每次口服250 mg，每日3次，5～10 d为1个疗程，可使粪便阴性。部分复发或治疗无效，可加大剂量为750 mg。对于不同的虫株，敏感性可能不同。对于耐药患者，可采用复方磺胺甲噁唑、痢特灵、双磺喹啉、黄连素或鸦胆子治疗[1]。黄道超等[20]认为，甲硝唑疗效好、不良反应小，廉价安全，使用方便，且具有抗厌氧菌作用，可被作为治疗人和动物阿米巴病的首选药物。

8 小 结

有学者指出，新现和再现感染性疾病已经成为影响人民健康重要的公共卫生问题。作为从事医学教育、研究、临床和预防的卫生工作者，应积极应对，不断学习，充实和扩大专业知识面，同时还要担负起宣传、教育的职责，提高全体民众的卫生防病意识[16]。

笔者强调，检验医学在临床及卫生领域起到举足轻重的作用，是临床医学不可缺的组成部分。增加新现和再现寄生虫的认识，提高寄生虫感染认识和寄生虫形态鉴别与检出率是当务之急，刻不容缓。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.028

A

1673-4130(2016)22-3168-05

2016-04-01

2016-06-07)

△通讯作者，E-mail：13436368811@163.com。