ILK介导Akt信号通路诱导人晶状体上皮细胞转分化的研究

朱玉广，朱 艳，孙宝琪，陈 晨，李 珺，李 霞



ILK介导Akt信号通路诱导人晶状体上皮细胞转分化的研究

朱玉广，朱 艳，孙宝琪，陈 晨，李 珺，李 霞

目的 研究ILK抑制剂QLT0267对转分化人晶状体上皮细胞(HLECs)E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化糖原合酶激酶-3β(p-GSK3β)的影响，探讨ILK介导Akt信号通路在HLECs转分化的作用。方法 选择传3代HLECs进行实验，实验分三组：TGF-β2组加入含有浓度为100 ng/L的TGF-β2培养基，ILK抑制剂组加入10 nmol/L QLT0267预处理1 h后，再加入浓度为100 ng/L TGF-β2培养基培养48 h，对照组加入无血清培养基。Western blot法检测HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的变化。采用免疫荧光技术检测HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt、p-GSK3β的表达。结果 与对照组比较，TGF-β组E-cadherin表达减弱，α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表达增强，差异有统计学意义。与TGF-β组比较，ILK抑制剂组α-SMA、p-Akt和p-GSK3β表达明显减弱，E-cadherin的表达明显增强，差异有统计学意义(F=12.325、17.686、8.547、6.812，P<0.001)，QLT0267部分逆转TGF-β诱导的HLECs α-SMA、p-Akt、p-GSK3β和E-cadherin的表达。结论 ILK介导Akt信号通路参与TGF-β2诱导的HLECs转分化过程，QLT0267通过特异性结合ILK，影响下游信号的传导，降低了HLECs的转分化。ILK介导Akt信号通路可能在后囊膜混浊过程中发挥重要作用。

ILK；Akt信号通路；晶状体上皮细胞；转分化；转化生长因子-β2

白内障是常见的致盲性眼病，后囊膜混浊(posterior capsular opacification，PCO)是现代白内障术后影响视力提高的主要因素[1]。人晶状体上皮细胞(human len epithelialcells，HLECs) 的转分化是PCO 的主要病理改变，转化生长因子-β2 ( transforming growth factor-β2，TGF-β2) 以诱导HLECs 的转分化[1-2]。前期研究[3-4]显示整合素β1参与TGF-β2诱导HLECs转分化，并且抑制整合素β1的表达可以抑制HLECs转分化。整合素激活后主要通过整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)发挥核心作用，ILK参与体内多个信号传导通路，ILK及其信号通道在HLECs转分化中的作用还未见报道。该研究利用HLECs转分化细胞模型，探讨Akt信号通道在HLECs转分化中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人晶状体上皮细胞HLEC-h3细胞株(上海复蒙基因生物科技有限公司)。

1.2 主要试剂 兔抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体(美国Sigma公司)；兔抗人磷酸化Akt(p-Akt)多克隆抗体、兔抗人磷酸化糖原合酶激酶-3β(p-GSK-3β)单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；兔抗人E-钙黏素(E-cadherin) 单克隆抗体(美国Santa Cruz 公司)；Recombinant Human TGF-β2(美国R&D Systems公司)；FITC-标记羊抗兔二抗(美国BETHYL公司)；DMEM 细胞培养液、胎牛血清(美国GIBCO公司)；ILK抑制剂QLT0267(加拿大 QLT公司)。

1.3 HLECs的复苏、培养与传代 取液氮冻存的HLEC-h3细胞株，放置于37 ℃水浴箱快速解冻，将细胞悬液移到离心管，加入DMEM细胞培养液(含10%胎牛血清)，吹打混匀，离心后弃去上清液，加入细胞培养液，吹打混匀后移到细胞培养瓶内，放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。每3～4 d换1次DMEM细胞培养液。待HLECs 90%融合后，胰蛋白酶(1 ∶3)消化传代。选择传3代的HLECs进行实验。

1.4 实验分组 制作HLECs细胞爬片，待HLECs达80%融合后，24 h血清饥饿培养后分组。分为对照组、TGF-β2组和ILK抑制剂组。对照组加入无血清培养基，TGF-β2组加入含浓度为100 ng/L的TGF-β2培养基，ILK抑制剂组预先加入10 nmol/L QLT0267孵育1 h，再加入浓度为100 ng/L TGF-β2培养基培养48 h后进行后续实验。

1.5 Western blot法检测HLECs α-SMA、E-cadherin、p-Akt和p-GSK3β的表达 细胞裂解法冰上裂解细胞提取蛋白，用BCA protein assay reagent测定蛋白浓度并配平，取变性蛋白20 g/孔加入10% SDS-PAGE凝胶进行电泳，恒压下蛋白转PVDF膜，脱脂奶粉封闭。分别加入相应一抗α-SMA(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000) 、p-Akt(1 ∶1 000)、p-GSK-3β(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶800)，4 ℃孵育摇床过夜。二抗(1 ∶3 000) 室温孵育1～2 h, PBS-T洗膜，用ECL化学发光试剂盒进行显色、曝光、显影并定影。UVP凝胶成像扫描分析系统对胶片条带进行吸光度(absorbance,A) 测定。

1.6 免疫荧光检测HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表达 取出HLECs细胞爬片，PBS冲洗2次，冷丙酮/甲醇(1 ∶1)固定20 min，10%正常山羊血清封闭1 h，分别加入相应兔抗人单克隆抗体，湿盒内4 ℃孵育过夜，滴加FITC-标记羊抗兔二抗，室温下避光孵育1 h。滴入20%甘油封片剂封片，荧光显微镜(德国Leica公司)观察并拍照。PBS代替一抗或二抗作为阴性对照。以绿色荧光为阳性表达，比较HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表达。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行分析，采用单因素方差分析和t检验进行比较。

2 结果

2.1 Western blot检测结果 Western blot 分析结果显示TGF-β2明显抑制E-cadherin的表达，TGF-β2明显促进α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表达。QLT0267能部分逆转TGF-β2诱导的HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表达。HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表达三组比较差异有统计学意义(F=12.325、17.686、8.547、6.812，P<0.05)，见图1。

图1 HLECs中E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的相对表达

2.2 免疫荧光法检测结果 免疫荧光结果显示：对照组HLECs E-cadherin在细胞膜上表达较强，ILK抑制剂组HLECs E-cadherin的表达减弱，TGF-β2组HLECs E-cadherin在细胞膜的表达明显减弱，转为细胞质或细胞核表达，分布较弥散(图2)。对照组HLECs α-SMA微量表达，ILK抑制剂组HLECs α-SMA的表达增强，TGF-β2组HLECs α-SMA的表达明显增强，主要表达于胞质内，并在细胞核周积聚(图3)。对照组HLECs p-Akt表达较弱，ILK抑制剂组HLECs p-Akt的表达增强，TGF-β2组HLECs p-Akt的表达明显增强，并向细胞膜聚集(图4)。与p-Akt的表达类似，对照组HLECs p-GSK3β表达较弱，ILK抑制剂组HLECs p-GSK3β的表达增强，TGF-β2组HLECs p-GSK3β的表达明显增强，主要在细胞膜表达并聚集，少量弥散于胞质和细胞核(图5)。

图2 免疫荧光检测HLECs E-cadherin的表达 ×400

图3 免疫荧光检测HLECs α-SMA的表达 ×400

图4 免疫荧光检测HLECs p-Akt的表达 ×400

图5 免疫荧光检测HLECs p-GSK3β的表达 ×400

3 讨论

白内障是临床上常见的致盲性眼病，白内障超声乳化联合人工晶体植入术是现代白内障治疗的最佳手术方式。但由于PCO的发生，引起患者部分视功能丧失。同时，PCO也是现代白内障术后影响视力提高的主要因素之一[5]。现代白内障手术保留了囊袋，囊袋残存的HLECs增生是白内障手术后PCO形成的主要原因[6]。研究[7]显示 HLECs的转分化是PCO 的主要病理改变。

前期研究[1-2]显示，TGF-β2可以诱导HLECs 的转分化。利用TGF-β2可以建立HLECs转分化细胞模型。利用HLECs转分化细胞模型，实验显示整合素β1参与TGF-β2可以诱导HLECs转分化，并且抑制整合素β1的表达可以抑制晶状体上皮细胞转分化[3-4]。整合素激活后主要通过ILK发挥核心作用[8]，ILK参与体内多个信号传导通路，ILK及其信号通道在HLECs转分化中的作用还未见报道。实验显示，TGF-β2处理后，培养的HLECs E-cadherin表达减弱，而α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表达增强，而HLECs经10 nmol/L QLT0267预处理后，α-SMA、p-Akt和p-GSK3β表达明显减弱，E-cadherin的表达明显增强。说明Akt信号通路参与TGF-β2诱导的HLECs转分化过程。

ILK是近年发现的丝/苏氨酸的蛋白激酶，依赖整合素的细胞粘着，通过ILK结合并磷酸化整合素β1亚单位，激活PI3K，磷酸化激活下游底物Akt、GSK-3β[9]，影响胞外信号向下游的传递，参与细胞的生长、分化等过程。QLT0267是人工合成的小分子蛋白，能自由地通过细胞膜，特异性结合ILK[10]。本研究显示，应用QLT0267后，HLECs p-Akt和p-GSK3β的表达明显下降，说明ILK介导Akt信号通路参与TGF-β2诱导的HLECs转分化过程，QLT0267通过特异性结合ILK，影响下游信号的传导，降低了HLECs的转分化，有可能抑制PCO的形成。QLT0267的作用从侧面证实了ILK参与了HLECs的转分化。

QLT0267部分抑制了TGF-β2诱导的HLECs转分化，但并没有完全阻断，提示可能还有其他的信号通道也参与了TGF-β2诱导的HLECs转分化过程，这需要进一步的深入研究，以期寻找、干预HLECs转分化或PCO形成的分子靶点，抑制PCO的产生。

[1] 朱 艳,朱玉广,钟莹莹,等.TGF-β2对晶状体上皮细胞间质转分化的影响[J].郑州大学学报(医学版),2012,47(5): 670-4.

[2] 朱 艳,朱玉广,钟莹莹,等.转化生长因子β2对人晶状体上皮细胞E-钙黏素和α-平滑肌肌动蛋白表达的影响[J].中国组织工程研究,2012,16(46):8636-40.

[3] 朱玉广,朱 艳,王 杰,等.整合素-β1在转化生长因子-β2诱导晶状体上皮细胞转化中的作用[J].山东大学学报(医学版),2012,50(11):58-61.

[4] 朱 艳,朱玉广,张立华,等.整合素β1介导的ERK/MAPK通道在晶状体上皮细胞转分化中的作用[J].眼科新进展,2012,34(4):318-21.

[5] Leydolt C, Kriechbaum K, Schriefl S,et al. Posterior capsule opacification and neodymium:YAG rates with 2 single-piece hydrophobic acrylic intraocular lenses: three-year results[J]. J Cataract Refract Surg, 2013,39(12):1886-92.

[6] Dong N, Xu B, Benya S R, et al. MiRNA-26b inhibits the proliferation,migration, and epithelial-mesenchymal transition of lens epithelial cells[J]. Mol Cell Biochem, 2014 ,396(1-2):229-38.

[7] Mamuya F A, Wang Y, Roop V H, et al. The roles of αV integrins in lens EMT and posterior capsular opacification[J]. J Cell Mol Med, 2014,18(4):656-70.

[8] Huet-Calderwood C, Brahme N N, Kumar N, et al. Differences in binding to the ILK complex determines kindlin isoform adhesion localization and integrin activation[J]. J Cell Sci, 2014,127(Pt 19):4308-21.

[9] Chen Z L, Haegeli V, Yu H, et al. Cortical deficiency of laminin gamma1 impairs the AKT/GSK-3beta signaling pathway and leads to defects in neurite outgrowth and neuronal migration[J].Dev Biol,2009,327(1):158-68.

[10]Younes M N, Yigitbasi O G, Yazici Y D, et al. Effects of the integrin-linked kinase inhibitor QLT0267 on squamouscell carcinoma of the head and neck[J]. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 2007,133(1):15-23.

Effect of Akt signal pathway mediated by ILK in epithelial mesenchymal transition of human lens epithelial cells

Zhu Yuguang,Zhu Yan,Sun Baoqi,et al

(TheEyeCenter,AffiliatedHospitalofWeifangMedicalCollege,Weifang261031)

ObjectiveTostudytheeffectofQLT0267onexpressionsofE-cadherin,α-SMA,p-Aktandp-GSK3βinhumanlensepithelialcells(HLECs),andinvestigatetheeffectofAktsignalpathwaymediatedbyILKinepithelialmesenchymaltransition(EMT)ofHLECsinducedbyTGF-β2.MethodsTheHLECswereculturedandpassagedin vitro.The3rdgenerationofHLECsweredividedinto3groups.TheHLECsinTGF-β2groupweretreatedwithTGF-β2(100ng/L)forinducementfor48hours.TheHLECsinILKinhibitorgroupwerepretreatedwithQLT0267(10 nmol/L) for 1 hour, then treated with TGF-β2(100 ng/L) for 48 h.The HLECs in the control group were cultured in serum-free medium.The expressions of E-cadherin, α-SMA, p-Akt and p-GSK-3β were analyzed by Western blot.The expressions of E-cadherin, α-SMA, p-Akt and p-GSK-3β were detected by cell fluorescence immunoassay.ResultsCompared with the control group, the expression of E-cadherin was decreased significantly, while the expressions of α-SMA, p-Akt and p-GSK3β were increased significantly in TGF-β2 group.Compared with TGF-β2 group, the expressions of α-SMA, p-Akt and p-GSK3β were decreased significantly, while the expression of E-cadherin was increased significantly in ILK inhibitor group(F=12.325, 17.686, 8.547, 6.812, allP<0.001). QLT0267 partly reversed TGF-β2 induced expressions of E-cadherin,α-SMA, p-Akt and p-GSK3β.ConclusionThese results suggest that Akt signal pathway mediated by ILK may be involved in the procedure of EMT of HLECs induced by TGF-β2.QLT0267 can specifically bind ILK,and partly inhibit the process of EMT.Akt signal pathway may play an important role in the progress of PCO.

ILK; Akt signal pathway; human lens epithelial cells; epithelial mesenchymal transition; transforming growth factor-β2

山东省优秀中青年科学家科研奖励基金计划(编号：BS2009SW016)；山东省医药卫生科技发展计划项目(编号：2015WS0047)

潍坊医学院附属医院眼科中心，潍坊 261031

朱玉广，男，副教授，博士； 朱 艳，女，讲师，责任作者，E-mail:azhu1975@sina.com

时间：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.014.html

R 776.1

A

1000-1492(2016)11-1617-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.014

2016-06-27接收