L-精氨酸对全血血小板膜GP2b/3a表达影响与临床检验学研究

尚晓东刘晓华宋明慧崔乃凡杨 琨

（1 辽宁省辽阳市康复医院检验科，辽宁 辽阳 111000；2 辽宁省辽阳市中心医院检验科，辽宁 辽阳 111000；3 辽宁省人民医院中心实验室，辽宁 沈阳 110016）

L-精氨酸对全血血小板膜GP2b/3a表达影响与临床检验学研究

尚晓东1刘晓华2宋明慧2崔乃凡2杨 琨3

（1 辽宁省辽阳市康复医院检验科，辽宁 辽阳 111000；2 辽宁省辽阳市中心医院检验科，辽宁 辽阳 111000；3 辽宁省人民医院中心实验室，辽宁 沈阳 110016）

目的 研究分析L-精氨酸对正常人血小板膜GP2b/3a表达的影响与临床意义。方法 建立全血血小板膜GP2b/3a表达的流式细胞术（FCM）测定方法，观察L-精氨酸在静息和活化状态下对正常人血小板膜GP2b/3a表达的影响。结果 L-精氨酸对静息血小板膜GP2b/3a表达无明显影响；而显著抑制凝血酶、胶原活化的血小板膜GP2b/3a的上调表达，且该效应呈剂量和时间依赖性。结论 L-精氨酸可抑制血小板膜GP2b/3a的表达。

L-精氨酸；GP2b/3a；流式细胞术；检验分析

近来年研究发现，一氧化氮（NO）具有多种生物学活性，如舒张血管、抑制血小板活性[1-2]等。目前有关一氧化氮对血小板膜糖蛋白表达的影响报道甚少，而L-精氨酸（一氧化氮的供体）体外作用于全血血小板的研究尚未见报道。本实验采用流式细胞术检测全血血小板膜糖蛋白GP2b/3a。表达的方法，观察体外L-精氨酸在不同因素作用下对血小板膜GP2b/3a表达的影响及作用机制，为寻找防治心血管疾病方法提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：40例健康青年人[男女各20例，18～32岁，平均年龄（26.2±1.8）岁]，2周内未服用任何药物。

1.2 主要试剂：L-精氨酸（100毫克/瓶，干粉，Sinma公司）：兔抗人纤维蛋白原抗体（1∶5，Fg-Ab，军事医学科学院），纯化小鼠ⅠgG（军事医学科学院），异硫氰酸荧光素（FⅠTC）标记的羊抗兔ⅠgG（军事医学科学院）；HEPES（Sigma公司）HEPES缓冲液（单位mmol/L：NaCl145，KCl 5，MgSO4，1，HEPES10，pH7.4）；凝血酶（Sigma公司）；胶原（苏州医学院血栓与止血室）；2%福尔马林盐液（37%福尔马林盐浓2 mL与1000 mL生理盐水混匀）。

1.3 实验方法：参照Janes和武艺[3-4]等方法，使用兔抗人纤维蛋白原抗体，建立全血血小板膜GP2b/3a表达的流式细胞术（FCM）测定方法。

采用真空采血器（WZK-9NC型，含3.8%枸椽酸钠）由专人经肘正中静脉取清晨空腹血液（不扎止血带，l次采血成功），弃去首2 mL，采集l mL脉血（血液∶抗凝剂＝9∶l）。静置2～3 min，取5 μL全血

分别加至3支含50 μL HEPES缓冲液的1.5 mL离心管中。其中，1号管不含激动剂，2号管含0.5 U/mL凝血酶10 μL，3号管含100 μg/mL胶原10 μL，室温下孵育20 min后，于各管中分别加入饱和浓度的Fg-Ab（l∶5）10 μL和FⅠTC-ⅠgG（l∶5）10 μL，各孵育20 min，之后用2%福尔马林盐液1 mL固定20 min，取l mL样品入FCM专用测试管内测定静息相、活化相全血血小板膜GP2b/3a表达，作自身对照。用同样方法检测L-精氨酸（1.0 mmol/L）对静息相、活化相全血血小板膜GP2b/ 3a表达和L-精氨酸在0、0、1、1.0、10 mmol/L浓度下对0.5 U/mL凝血酶诱导的血小板膜GP2b/3a表达的量效关系以及L-精氨酸孵育0、10、20、30 min后对0.5 U/mL凝血酶诱导的血小板膜GP2b/3a表达的时效关系。空白对照组用缓冲液代替GP2b/3a，阴性对照组用纯化小鼠ⅠgG代替GP2b/3a。

1.4 观察和测量：应用流式细胞仪（美国EPⅠCS ELⅠTE型）对全血血小板膜GP2b/3a进行荧光定量，设置空白对照组用缓冲液取代GP2b/3a，阴性对照组用ⅠaG代替GP2b/3a，以消除本底荧光的影响。每例样本测定10000个血小板，测量每例样本血小板平均荧光强度（MFⅠ），单位为阳性荧光道数，以此作为血小板膜GP2b/3a的表达量，凡大于正常人血小板膜表面荧光强度的99%的血小板定为阳性血小板，即为活化血小板，阳性血小板百分率（FC%）＝阳性血小板数/10000。

1.5 统计学处理：实验数据用SPSS统计软件中配对t检验、多个样本均数比较方差分析、两两比较SNK方法进行统计，P＜0.05差异具有统计学意义。

2 结 果

2.Ⅰ L-精氨酸对正常人全血血小板膜GP2b/3a表达（FC%）的影响：表1结果显示：静息血小板膜GP2b/3a表达含量（FC%）很低，凝血酶、胶原活化后GP2b/3a表达显著增加（P＜0.05。L-精氨酸（lmmol/L）对静息血小板膜表达无明显影响（P＞0.05）。但显著抑制凝血酶、胶原活化诱导的血小板膜GP2b/3a（P＜0.05）。

表1 L-精氨酸对血小板膜GP2b/3a表达（FC%）的影响（）

表1 L-精氨酸对血小板膜GP2b/3a表达（FC%）的影响（）

注：#P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.05

Group resting thrombin collagen Control 11.21±1.35 77.23±1.90** 73.35±1.20** L-arg 11.60±1.31# 41.52±1.66* 38.80±1.78*

2.2 L-精氨酸对凝血配诱导的血小板膜GP2b/3a表达的量效、时效关系：表2结果显示，L-精氨酸在0-10mmol/L范围内对凝血酶诱导的GP2b/3a表达具有抑制作用，且效应该呈剂量依赖性，线性关系良好（R2=0.9635），方差分析表明，各组之间有显著的统计学差异（P＜0.05）。SNK法显示各级间两两比较有显著的统计学差异（P＜0.05）。表3结果表明，1 mmol/L的L-精氨酸与全血血小板孵育0～30 min范围内对凝血诱导的GP2b/3a表达具有抑制作用，且效应呈时间依赖性，线性关系良好（R2=0.8935），方差分析表明，各组之间有显著的统计学差异（P＜0.05）。

表2 L-精氨酸对凝血酶诱导的GP2b/3a表达的量-效关系（）

表2 L-精氨酸对凝血酶诱导的GP2b/3a表达的量-效关系（）

注：n=10，#P＜0.05vs group1，*P＜0.05vs group2，△P＜0.05vs group3

GROUPS GPⅡb/Ⅲa Group1(0mmol/L) 58.40±1.20 Group2(0.1mmol/L) 47.10±1.50#Group3(1mmol/L) 32.42±1.14#* Group4(10mmol/L) 28.02±1.27#*△

表3 L-精氨酸对凝血酶诱导的GP2b/3a表达的时-效关系（）

表3 L-精氨酸对凝血酶诱导的GP2b/3a表达的时-效关系（）

注：n=10，#P＜0.05vs group1， P＜0.05vs group2，△P＜0.05vs group3

GROUPS GPⅡb/Ⅲa Group1(0 min) 58.40±1.20 Group2(10 min) 54.90±3.18#Group3(20 min) 32.42±1.14#* Group4(30 min) 29.08±1.10#*△

3 讨 论

L-精氨酸为合成NO的前体，可通过NO途径抑制血小板活性，研究表明，血小板表面具有L-arg运输系统，给予L-精氨酸后血小板合成NO增加77%。本研究首次在体外证明，L-精氨酸对正常青年人经血小板激动剂凝血酶和胶原活化的全血血小板GP2b/3a的表达具有抑制作用，并呈时间和剂量依赖性。本实验为全血中研究NO对血小板的作用机制提供了一条新途径，同时也为饮食中补充适量精氨酸防治心血管病提供了理论依据。

[1] 慕容洋洋,边彤,苏宁. L-精氨酸对全血血小板膜GP2b/3a表达影响与检验学研究[J].中华医学检验杂志,2015,38(3):166-168.

[2] 白继文,王长印.检验医学问答[M].北京:人民卫生出版社,2008: 161-169.

[3] 陈杰,孙静,李华丽.L-精氨酸对血小板膜GP2b/3a表达影响的临床检验学研究[J].中国卫生检验杂志,2015,38(3):31-33.

[4] 武艺,左连富,曹雪笠,等.冠心病患者血小板膜结合纤维蛋白原免疫荧光定量研究[J].中华心血管病杂志,2015,43(3):200-202.

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B

1671-8194（2016）32-0092-02