禽核酸疫苗的研究进展

唐静静　周巧丽　殷光文　江和基　黄志坚（福建农林大学动物科学学院福建省动物药物工程实验室福州350002）

禽核酸疫苗的研究进展

唐静静周巧丽殷光文江和基黄志坚*
（福建农林大学动物科学学院福建省动物药物工程实验室福州350002）

本文对禽用（鸡、鸭、火鸡）核酸疫苗的研究进行综述。首先描述禽用核酸疫苗的进展：病原，质粒以及免疫途径。其次，描述提高核酸疫苗免疫效果的方式：接种途径，疫苗剂量以及首免时间，增加宿主细胞对质粒的摄入，添加免疫增强分子，优化质粒骨架和密码子，疫苗抗原的选择，异源性的首免-加强免疫策略。最后，描述禽用核酸疫苗的其他特点：接种后质粒的去向，免疫反应的特点以及核酸疫苗的其他用途。

核酸疫苗禽类传染病佐剂免疫途径

禽用核酸疫苗由载体和其表达的病原抗原组成，可以在动物体内产生体液免疫和细胞免疫应答；核酸疫苗适于大规模免疫，安全、便宜，可以区分野毒感染；核酸疫苗可以在常温下保存较长时间，储存运输方便；此外，球虫核酸疫苗可以减少抗球虫药物的使用，进而减少肉类兽药残留。

1　禽类核酸疫苗免疫模式

1990年，Wolff发现在小鼠肌肉内注射质粒，可以引起目标蛋白的显著表达［1］。这是核酸免疫的最早研究，随后，人、动物包括禽类上面的核酸疫苗研究越来越多，目前已经有四种动物用核酸疫苗上市（马西尼罗河病毒疫苗、犬黑色素瘤疫苗、鱼传染性造血组织坏死病疫苗以及猪生长激素释放激素疫苗）。但是目前还没有禽用核酸疫苗上市。

文献中有75%的禽用核酸疫苗研究针对鸡，20%针对鸭，剩下的针对火鸡。有75%的研究针对病毒病，20%的研究针对球虫病，剩下的针对细菌病。

1993年最早的禽用核酸疫苗是针对禽流感病毒［2］。之后，在鸡上，流感病毒的核酸疫苗研究越来越多，鸭上也有部分研究。流感病毒的核酸疫苗已经取得比较好的效果，基于HA蛋白的核酸疫苗一次免疫可以对致死攻毒产生90%以上的保护。另外一项研究用沙门氏菌活载体携带核酸疫苗口服免疫鸡，也可以提供很好的保护，免疫后2周和4周，鸡体内的CD4+和CD8+均有显著增加，鸡血清的血抑效价和机体内Th1类的细胞因子也比对照组高。传染性法氏囊病毒核酸疫苗的研究也取得不错的进展，一项研究首免用核酸疫苗，加强免疫用蛋白疫苗（所选抗原为VP2），用强毒攻毒，产生完全的保护［3］；另一项研究，首免用核酸疫苗进行蛋内免疫（所选抗原为VP243），加强免疫用灭活的病毒疫苗免疫，同样对试验攻毒可以产生完全的保护。鸡传染性支气管炎病毒的核酸疫苗研究也比较多，质粒表达S1、N或者M蛋白免疫后可以对攻毒产生60%～90%的保护。在鸭上面，研究最多的核酸疫苗是针对鸭肝炎病毒，核酸疫苗免疫可以对该病毒的感染产生一定的抗病毒效应［4］。针对鸡其他病毒的核酸疫苗研究较少。基于呼肠孤病毒σ蛋白的核酸疫苗可以产生66.7%～75%的保护。滴鼻免疫基于新城疫F蛋白的核酸疫苗可以对新城疫病毒的攻毒产生完全的保护。核酸疫苗在马立克氏病病毒上可产生55%的保护。传染性喉气管炎病毒的核酸疫苗（基于gpB蛋白）免疫后可以减少65%～75%的死亡率。基于网状内皮增生性病毒gp90的核酸疫苗免疫后可以引起中和抗体反应以及淋巴细胞增生，可以对攻毒后鸡的贫血产生保护［5］。鸡贫血病毒的核酸疫苗也可以引起鸡的血液中和抗体，IL-2和IFN-γ，以及脾细胞增生，可以对攻毒后鸡的贫血产生部分保护［6］。基于火鸡鼻气管炎病毒F蛋白的核酸疫苗免疫后，攻毒7 d后出现临床症状的火鸡从50%～60%降低到20%～30%［7］。鸭肠炎病毒核酸疫苗免疫后可以在鸭体内产生IgG、IgA以及中和抗体，攻毒后，80%的鸭可以存活［8］。基于鸭瘟病毒gpC抗原的核酸疫苗免疫后可以诱导鸭产生IgG，中和抗体，还可以产生淋巴细胞增殖反应［9］。

球虫核酸疫苗研究也比较多，这些核酸疫苗免疫后大部分均可以产生较好的免疫反应，对球虫的攻毒可以产生部分保护，临床指标如体重损失、肠道病变计分以及卵囊排出量均有明显改善［10］。

禽用细菌核酸疫苗研究较少。基于火鸡鹦鹉热衣原体MOMP抗原的核酸疫苗免疫后在火鸡体内产生的抗体水平较低，对试验感染产生的保护水平也不高［11］。空肠弯曲弧菌的核酸疫苗免疫鸡后可以显著减少鸡肠道细菌载量。基于多杀巴氏杆菌Omp H和Omp A的核酸疫苗免疫后可对细菌感染产生75%的保护［12］。

2　禽类核酸疫苗质粒选择

核酸疫苗基本上包括载体质粒及其表达的蛋白。禽用核酸疫苗的载体和哺乳动物所用的载体类似，主要有pcDNA、pVAX和pCI等。这些质粒都包括一个来源于病毒的强启动子和终止序列。有部分研究人员选用pCAGGS质粒，其启动子是鸡的β肌动蛋白启动子，可以增强疫苗的效力。在某些情况下，人们选用pIRES质粒，该质粒可以同时表达两种抗原，或者表达一种抗原和一种佐剂分子［13］。

3　禽类核酸疫苗免疫途径和剂量

免疫途径主要包括四种：肌肉注射、皮内或皮下注射、黏膜免疫（经口或滴鼻免疫）以及蛋内注射。鸡首免的日龄从1日龄到5～6周龄。大部分情况下，核酸疫苗溶在水溶液中被直接注射到胸肌或腿肌，一般多点注射，如首免注射左腿肌肉，二免注射右腿肌肉［14］。有的研究人员将肌肉注射与其他免疫方式（滴鼻、腹腔注射、皮内或静脉注射）混用。口服免疫是第二种较普遍的免疫方式，通常是用致弱的细菌如沙门氏菌或大肠杆菌携带质粒，用细菌口服免疫鸡。比较少的情况下，质粒与微球如聚乳酸-羟基乙酸共聚物或壳聚糖混合滴鼻免疫鸡。黏膜免疫更适合大规模免疫，细菌和微粒可以雾化到空气中，或添加到水和食物中。在鸡胚18日龄时进行蛋内免疫对鸡来说是一种最有效的大规模免疫方式，蛋内免疫可以用仪器自动进行，一次蛋内免疫通常不能激发很好的保护性免疫应答，在7 d或14 d用致弱的活疫苗或重组的痘病毒疫苗加强免疫可以比传统免疫方式激发更好的免疫反应［15］。加强免疫用核酸疫苗也可以激发一定的保护性免疫应答。

70%的研究选用的免疫剂量为50～200 ug质粒，10%的研究如果注射点用电击或其他方式加强吸收，可以选用较少的质粒剂量。还有研究人员选用的质粒剂量比较大，多达500 ug或10 mg，这种情况下，疫苗的花费将比较大，将影响其工业化应用。

研究人员通常用核酸疫苗以同样的方式进行两次或多次注射诱导保护性免疫反应。还有一些加强免疫通常是为了提高后代母源抗体的水平，或者制备诊断血清，或者治疗慢性传染病。免疫间隔时间没有固定的标准，通常为1周～4周，比较普遍的间隔时间是1周或2周，这种间隔时间通常可以有效激活机体的免疫系统。

4　提高核酸疫苗效果的方式

通常核酸疫苗免疫激发的保护性免疫应答效果有限，需要采取一些方法进行改善。需要考虑的方面如下：接种途径，疫苗剂量以及首免时间，增加宿主细胞对质粒的摄入，添加免疫增强分子，优化质粒骨架和密码子，疫苗抗原的选择，异源性的首免-加强免疫策略。

5　禽用核酸疫苗的其他特点

很少有人研究核酸疫苗是怎样在禽上激发保护性免疫应答的。不过，有一些研究描述了接种后质粒的命运。还有一些研究核酸疫苗免疫后，对特定免疫细胞的刺激作用，以及母源抗体对免疫的影响。有人研究核酸疫苗免疫后的其他作用。

5.1核酸疫苗免疫后质粒的去向核酸疫苗免疫后质粒在鸡体内的去向研究得比较少。免疫后第5d和第15 d，在鸡的血液、肝脏、脾脏、肺部、肾脏、肌肉以及心脏均可以发现质粒。但在哺乳动物上，肌肉注射的部位多达3周均可以检测到质粒，但是其他肌肉部位，仅仅在免疫后1～7 d可以检测到。免疫后，没有发现质粒DNA可以整合到宿主DNA中，也没有发现质粒DNA进入到鸡肠道细菌中。用沙门氏菌载体携带核酸质粒经口免疫，免疫后多达6周都可以在鸡的脾脏、肝脏、盲肠检测到质粒。蛋内免疫2 h，在鸡的尿囊液中已检测不到质粒。质粒已经到达鸡胚并分布到鸡的全身［16］。

5.2核酸疫苗的免疫学核酸疫苗可以激发宿主的体液免疫和细胞免疫应答。研究发现，免疫后鸡和鸭的CD4+和CD8+T细胞均可以增值［17］。鸡的先天性免疫系统到4周的时候才会完全发育成熟，因此，幼龄鸡在出生后2周到3周需要母源抗体的保护。但是，很少有研究报道母源抗体对禽用核酸疫苗免疫效果的影响。大多数情况下，研究人员用SPF鸡或者没有母源抗体的鸡做试验。少数的几项研究表明，在有母源抗体的情况下，需要加大质粒的剂量、增加免疫次数才可以对鸡传染性法氏囊病病毒的感染激发较好的免疫保护。对于新城疫病毒，母源抗体则阻碍了核酸疫苗的效果。在火鸡上，母源抗体影响了核酸疫苗对鹦鹉热衣原体的体液免疫应答，但对细胞免疫和保护性免疫应答没有影响［18］。

5.3禽用核酸疫苗的其他应用大多数情况下，DNA免疫是要诱导机体产生预防性的保护性免疫应答。但是，DNA免疫也有其他一些应用。有研究人员将DNA疫苗与药物联合应用治疗鸭乙型肝炎病毒感染；DNA免疫被用来生产用于诊断的参考血清；DNA免疫被用来产生针对虾白斑综合征病毒的抗体［19］。DNA免疫还被用来延缓鸡肿瘤的发生［20］。

6　结论

DNA免疫对于禽类（鸡、鸭、火鸡）来说是一种简单合适的免疫方式。该种免疫方式在对抗禽类病毒、细菌以及球虫方面都取得了成功。一些方法可以被用来增强疫苗的免疫效果；一些免疫方法适合大规模免疫。尽管自1993年以来有大量的禽用核酸疫苗研究，但是目前还没有一种进入商业化生产。可能是因为大部分研究采用的是肌注方式，而且免疫了至少两次，这些在实际应用中并不方便。还有大量的研究采用SPF动物，而实际中大部分幼龄鸡可能存在母源抗体，在某种程度上会影响DNA疫苗的效果。尽管这样，还是有一些研究在母源抗体存在的情况下取得了免疫保护，表明至少针对某些病原，母源抗体并不影响核酸疫苗的效果。因此，我们需要采取更多的方法开发适合大规模应用、可以克服母源抗体干扰的禽用核酸疫苗。

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DNA vaccination of poultry

Tang Jingjing Zhou Qiaoli Yin Guangwen Jiang heji Huang Zhijian*
（College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Engineering Laboratory of Animal Pharmaceuticals，Fuzhou 350002）

This review describes studies in this field performed exclusively on birds（chickens，ducks and turkeys）.No evaluations of avian DNA vaccine efficacy performed on mice as preliminary tests have been taken into consideration.The review first describes the state of the art for DNA vaccination in poultry∶pathogens targeted，plasmids used and different routes of vaccine administration.Second，it presents strategies designed to improve DNA vaccine efficacy∶influence of the route of administration，plasmid dose and age of birds on their first inoculation；increasing plasmid uptake by host cells；addition of immunomodulators；optimization of plasmid backbones and codon usage；association of vaccine antigens and finally，heterologous prime-boost regimens.The final part will indicate additional properties of DNA vaccines in poultry∶fate of the plasmids upon inoculation，immunological considerations and the use of DNA vaccines for purposes other than preventing infectious diseases.

DNA vaccine Avian Infectious diseases Adjuvants Routes

A

1003-4331（2016）05-0050-04

国家自然科学基金（31502058）、福建省教育厅科研项目（JA15159）、大学生创新项目（201610389148）资助。

唐静静（1993-），女，河南商丘人，本科生，主要从事动物医学研究。Email：970339298@qq.com。

黄志坚（1963-），男，福建惠安人，教授，从事动物疾病防治与保健。E-mail：huangzj1999@sina. com。