刺五加水提取物的抗氧化活性研究

田松阳,于成龙,徐 微,4,*,陈铁云,孙 擎,王君妍,李 妍

(1.哈尔滨学院工学院食品科学与工程系,黑龙江哈尔滨 150086;2.黑龙江职业学院,黑龙江哈尔滨 150080;3.东北林业大学野生动物资源学院,黑龙江哈尔滨 150040;4.乳品科学教育部重点实验室,东北农业大学,黑龙江哈尔滨 150030)



刺五加水提取物的抗氧化活性研究

田松阳1,于成龙2,3,+,徐 微1,4,*,陈铁云1,孙 擎1,王君妍2,李 妍1

(1.哈尔滨学院工学院食品科学与工程系,黑龙江哈尔滨 150086;2.黑龙江职业学院,黑龙江哈尔滨 150080;3.东北林业大学野生动物资源学院,黑龙江哈尔滨 150040;4.乳品科学教育部重点实验室,东北农业大学,黑龙江哈尔滨 150030)

采用热水浸提法对刺五加中水溶性成分进行提取,以浸提液对DPPH自由基的清除率为评价指标,研究了浸提温度、浸提时间、料液比、浸提次数对其抗氧化活性的影响,从而确定最佳提取条件。正交实验结果表明,在浸提温度为70 ℃、提取时间110 min、料液比1∶80(g/mL),提取次数为2次的条件下,浸提液对DPPH自由基的清除率可达69.14%。此外,将最佳条件下获得的刺五加水提取物的清除DPPH自由基、O2-·自由基和·OH自由基能力与维生素C进行对比分析。结果表明,浸提液对 O2-·自由基的清除能力显著低于维生素C(p<0.05),其清除率为31.69%;而浸提液对超氧阴离子和羟自由基的清除率均显著高于维生素C(p<0.05),其中对羟自由基的清除率达到76.03%。

刺五加,提取,抗氧化性质,自由基

刺五加(AcanthopanaxsenticocusHarms)是多年生木本植物,属伞形目五加科植物。主要分布在我国黑龙江、吉林、辽宁和河北等地,是我国东北地区典型的药用植物,它也是经国家卫生部批准颁布的药食同源中药之一。刺五加中含有丰富的生物活性成分,如刺五加多糖、刺五加总皂苷、β-谷甾醇、胡萝卜苷和紫丁香树脂醇苷等,其中部分活性物质具有营养保健作用。中医和本草纲目认为,刺五加具有益气健脾和补肾安神的功效[1]。大量研究也证实了,它能有效治疗心脏病、高血压、风湿病和糖尿病等多种疾病[2-4],此外,它还具有较强的免疫活性,能促进T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞对细胞因子的分泌[5-6]。而近些年研究人员发现,刺五加存在一定的抗氧化活性和抗肿瘤作用[7-9]。因此,对刺五加生物活性成分的抗氧化能力探究成为近些年的主要研究内容。

目前,刺五加有效成分的提取方法有微波法、超声波法、超临界二氧化碳萃取法、有机溶剂法等。但在提取过程中,这些方法可能会对有效成分的活性产生一定影响,因此,本研究采用热水浸提法提取刺五加的有效成分,并以其清除DPPH自由基的能力为指标,通过正交实验优化提取工艺,并配以维生素C作为对照,研究其超氧阴离子自由基和羟自由基的清除能力,为刺五加的进一步开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺五加 黑龙江省中药联营总公司批发四部;DPPH Sigma公司;无水乙醇 天津市永大化学试剂有限公司;番红 北京中生瑞泰科技有限公司;邻苯三酚 上海展云化工有限公司;抗坏血酸 深圳安泰生物科技有限公司,等;所有试剂均为分析纯。

T6型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;FA224型电子分析天平 上海海康电子仪器厂;DK-98-11A型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;FK-A型组织捣碎机 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂;Alpha 1-4 中型冻干机真空冷冻干燥机 德国Matin Christ;202A-F型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司,等。

1.2 实验方法

1.2.1 有效成分的提取 将刺五加洗净,烘干至恒重后粉碎,过20目筛子。根据反应条件,准确称取刺五加粉末,加入蒸馏水,用匀浆机进行处理得到匀浆液。采用热水浸提法对刺五加的有效成分进行提取,提取液冻干备用。

1.2.2 单因素实验设计

1.2.2.1 浸提温度对DPPH自由基清除率的影响 在料液比为1∶40(g/mL),浸提时间为120 min,提取次数为1次的浸提条件下,研究浸提温度(40、50、60、70、80、90 ℃)对DPPH自由基清除率的影响。

1.2.2.2 浸提时间对DPPH自由基清除率的影响 在料液比为1∶40(g/mL),浸提温度为70 ℃,提取次数为1次的浸提条件下,研究浸提时间(30、60、90、120、150 min)对DPPH自由基清除率的影响。

1.2.2.3 料液比对DPPH自由基清除率的影响 在浸提温度为70 ℃,浸提时间为90 min,提取次数为1次的浸提条件下,研究料液比(1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100)(g/mL)对DPPH自由基清除率的影响。

1.2.2.4 浸提次数对DPPH自由基清除率的影响 在浸提温度为70 ℃,浸提时间为90 min,料液比为1∶60(g/mL)的条件下,研究提取次数(1、2和3次)对DPPH自由基清除率的影响。

1.2.3 正交实验设计 在单因素实验的基础上,固定提取次数为2次,选择提取温度、提取时间以及料液比三个因素,以提取物对DPPH自由基的清除率为指标,设计四因素三水平正交实验,正交实验表L9(34)如表1所示。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.2.4 提取物抗氧化性质的评价 通过测定提取物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除能力,来评价提取物的抗氧化性质。本研究以浓度为0.1 mg/mL维生素C作为对照。

1.2.4.1 提取物对DPPH自由基的清除能力的测定 通过测定刺五加提取物的DPPH自由基清除率可以评定其抗氧化活性。采用Nsimba R Y等[10]和Shimada K等[11]的方法,并作适当修改。配制终浓度为20 μmol/L的DPPH无水乙醇溶液,提取物的冻干粉配制成浓度为0.5 mg/mL的溶液,将DPPH乙醇溶液与提取物样品以1∶2的比例混合,室温下避光反应30 min后于517 nm处测定其吸光值,同时利用无水乙醇进行空白实验,平行实验三次。

DPPH自由基清除率的计算公式如式(1):

式(1)

其中:A517空白-空白样在517 nm处的吸光值;A517样品-待测样在517 nm处的吸光值。

1.2.4.2 提取物对超氧阴离子自由基的清除能力的测定 本实验采用邻苯三酚自氧化法[12]。在试管中加入4.5 mL pH8.2的磷酸缓冲溶液和1 mL浓度为0.5 mg/mL的刺五加提取物,25 ℃水浴加热20 min,再加入于25 ℃预热的0.4 mL浓度为25 mol/L的邻苯三酚溶液,震荡反应3 min后立即加入100 μL 3%抗坏血酸,混匀后于320 nm处测定其吸光度。

O2-·自由基清除率的计算公式如式(2):

式(2)

其中:A0-不加样品时吸光度;A1-加入样品的吸光度;A2-不加邻苯三酚样品的吸光度。

1.2.4.3 提取物对羟基自由基(·OH)清除能力的测定 该测定方法参照刘立新等[13]的方法,并略作改动。在试管中加入1.0 mL磷酸盐缓冲溶液。0.2 mL番红,1.0 mL EDTANa2-Fe2+,再加入0.5 mg/mL的刺五加提取物7.0 mL,最后加入H2O2溶液0.8 mL,于40 ℃水浴30 min后在520 nm处测定吸光度值,同时利用蒸馏水进行空白实验,利用等体积的H2O2和蒸馏水溶液进行对照实验,平行实验三次。

羟自由基清除率的计算公式如式(3):

式(3)

其中:A517空白-空白样在517 nm处的吸光值;A517样品-待测样在517 nm处的吸光值;A517对照-对照样在517 nm处的吸光值。

1.2.5 数据处理 本研究中数据均以平均值±标准偏差表示;采用spss 16软件对数据进行显著性分析;采用Excel(2003)软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 浸提温度对自由基清除率的影响 按照1.2.2.1的提取条件,结果如图1所示。随着反应温度的升高,提取物对DPPH自由基清除清除率呈现先增大再减小的趋势,且在70 ℃时清除率最高达到54.12%。当温度高于80 ℃时,提取物对自由基的清除率开始下降。这可能是因为温度升高,分子热运动加剧,有利于有效成分的解吸和溶解,浸提效率增大,刺五加提取物中抗氧化活性物质的浓度在不断的增大。但当温度过高时,部分有效成分开始降解,或者发生其他化学反应,从而提取物的抗氧化活性反而下降。考虑到能耗,选择70 ℃为最佳反应温度。

图1 浸提温度对DPPH自由基清除率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the free radical scavenging rate of DPPH

2.1.2 浸提时间对自由基清除率的影响 按照1.2.2.2的提取条件,结果如图2。提取物对DPPH自由基清除清除率随着浸提时间的延长而增大,在90～150 min,清除率增加较缓慢。这是由于在提取的前期阶段,提取物中抗氧化有效成分含量低,原料组织中有效成分含量高,浓度梯度大,抗氧化成分由原料内部向浸提液中扩散的传质动力较大,因此随着浸提时间的增加,浸提液中抗氧化成分的含量迅速增加。而随着浸提时间的继续增加,抗氧化成分的浓度梯度逐渐减小,故浸提效率降低。综合考虑,浸提时间选择90 min 较为适宜。

2.1.3 料液比对自由基清除率的影响 按照1.2.2.3的提取条件,结果如图3。从图中可以看出,随着物料与浸提液比例的增大(即浸提体系刺五加匀浆液浓度的降低),提取物对DPPH自由基清除清除率呈不断增加的趋势,因为浓度差是渗透和扩散的主要推动力,故低浓度的浸提体系,抗氧化活性物质的提取效率会增加。但当料液比大于1∶60(g/mL)以后,再继续增大料液比,提取物的抗氧化效果增加不显著,故选取料液比为1∶60(g/mL)。

图3 料液比对DPPH自由基清除率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the free radical scavenging rate of DPPH

2.1.4 浸提次数对自由基清除率的影响 按照1.2.2.4的提取条件,结果如图4。增加提取次数,可增大提取物对DPPH自由基清除率。2次提取比1次提取的提取物对DPPH自由基清除率提高了24.96%。当提取次数增加为3次时,提取物的抗氧化活性较2次时略有增加,统计分析结果为不显著。综合考虑能耗和经济性,提取次数为2次为宜。

图4 浸提次数对DPPH自由基清除率的影响Fig.4 Effect of extraction times on the free radical scavenging rate of DPPH

2.2 正交实验结果

正交实验结果如表2所示。由直观分析可知,当浸提温度为70 ℃、提取时间90 min、料液比1∶80(g/mL)及提取次数2次,提取物对DPPH自由基的清除率最高为66.25%。通过极差分析可以看出,各因素对抗氧化活性的影响程度为C>A>B,即料液比>浸提温度>浸提时间。因本研究的最优实验条件A2B3C3不在正交实验中,故对此实验条件进行验证实验。

表2 正交实验设计方案及结果Table 2 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental results

2.3 验证实验及对其他自由基清除能力的分析

在反应温度为70 ℃、提取时间110 min、料液比1∶80(g/mL),提取次数为2次的条件下,分别测定刺五加提取物对DPPH自由基、O2-·自由基及·OH自由基的清除率。同时,测定维生素C的抗氧化活性。结果如表3。从结果可以看出,在最优实验条件下,提取物对DPPH自由基、O2-·自由基、·OH自由基清除率分别为69.14%、31.69%、76.03%。且对DPPH自由基及·OH自由基的清除效果均好于维生素C,体现了良好的抗氧化性。

表3 验证实验结果及对O2-·自由基 和·OH自由基清除能力的分析(%)Table 3 Verification experiment and analysis of the scavenging rate of superoxide anion radical and hydroxyl radical(%)

事实上,刺五加提取物中含有多种具有功能活性的化学成分,如苷类、萜类、黄酮、多糖、维生素和矿质元素等。近年来,国内外学者对刺五加的化学成分进行了深入广泛的研究,刺五加苷、紫丁香苷和异嗪皮啶等为主要活性成分[14-16]。李志峰等从刺五加提取物中分离鉴定了12个化合物,其中包括苷类、多糖、刺五加酮等化合物[17]。张涛等从长白山区刺五加中分离到了11个化合物,其中四种具有较好的自由基清除活性,其对DPPH自由基清除作用的IC50值分别为0.01、0.01、0.01、0.66 μg/mL[18]。本文未对提取物的化学成分进行分析,在未来的研究中将做进一步探讨。

3 结论

本研究结果表明,刺五加热水浸提物具有很好的抗氧化活性,通过正交实验得到最佳的提取条件为:反应温度为70 ℃、提取时间110 min、料液比1∶80(g/mL)、提取次数为2次。提取物对DPPH自由基、·OH自由基的清除率均好于维生素C,对O2-·自由基也有一定的清除效果。刺五加资源丰富且无毒副作用,提取物可以作为一种营养保健成分或天然的抗氧化剂添加到食品中,这对植物资源的综合开发利用具有重要的意义。

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Antioxidant activity of water extraction fromAcanthopanacissenticosus

TIAN Song-yang1,YU Cheng-long2,3,+,XU Wei1,4，*,CHEN Tie-yun1,SUN Qing2,WANG Jun-yan1,LI Yan1

(1.Department of Food Science and Engineering,Harbin University,Harbin 150086,China;2.Heilongjiang Polytechnic,Harbin 150080,China;3.College of Wildlife Resources,Northeast Forest University,Harbin 150040,China;4.Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

WatersolublecomponentsofAcanthopanax senticosuswereextractedbyhotwater,extractionliquidonDPPHfreeradicalscavengingrateasevaluationindex,theeffectoftheextractiontemperature,extractiontime,solid-liquidratioandextractiontimesontheantioxidantactivitywerestudiedtoobtaintheoptimalextractioncondition.Orthogonaltestshowedthattheoptimialconditionswerereactiontemperatureof70 ℃,extractiontimeof110min,materialliquidratioof1∶80(g/mL),twiceextraction,andtheremovalratewastheDPPHfreeradicalscavengingratewas69.14%.Inaddition,DPPH,superoxideanionandhydroxylradicalscavengingactivitiesoftheextractionobtainedunderoptimalextractionconditionandvitaminCwereanalyzed.ResultsshowedthatsuperoxideanionradicalscavengingactivitiesoftheextractionwaslowerthanvitaminC(p<0.05),andscavengingratewas31.69%.However,DPPHandhydroxylradicalscavengingactivitiesoftheextractionwerehigherthanvitaminC(p<0.05),andhydroxylradicalscavengingratewas76.03%.

Acanthopanacis senticosus;extraction;antioxidantactivity;freeradical

2016-04-08

田松阳(1993-)，女，在读本科生，研究方向：食品加工，E-mail:1714389909@qq.com。 于成龙(1983-)，男，讲师，在读博士研究生，研究方向：旅游管理及野生植物资源开发，E-mail:yuchenglong1983@126.com。

*通讯作者:徐微(1982-)，女，在读博士研究生，讲师，主要从事食品化学和营养学研究，E-mail:xweihappy@163.com。

黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(201510234001);哈尔滨学院学生科研项目(HXS20161344)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)21-0110-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.013