罗伊氏乳杆菌LT018高密度培养生长因素的研究

刘 栋,胡亚民,刘洪吉,朱振军,李全阳,*

(1.广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004;2.山东省泰安市第一中学,山东泰安 271000)



罗伊氏乳杆菌LT018高密度培养生长因素的研究

刘 栋1,胡亚民2,刘洪吉1,朱振军1,李全阳1,*

(1.广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004;2.山东省泰安市第一中学,山东泰安 271000)

罗伊氏乳杆菌LT018是经过筛选的源自巴马百岁老人粪便中的优良益生菌株。为优化出适合其高密度生长的培养基,本研究以TPY为基础培养基,采用单因素方法确定增值培养基的成分为胰蛋白胨、酵母粉、麦芽糖、柠檬酸、柠檬酸钠、西红柿汁和L-半胱氨酸。采用Plackett-Burman实验设计方法得出胰蛋白胨、柠檬酸和L-半胱氨酸对菌株LT018的生长影响显著,继而进行最陡爬坡实验,通过RSM 确定显著因子的最优组合为:胰蛋白胨含量12.13 g/L,柠檬酸0.4 g/L,L-半胱氨酸0.6 g/L。在上述培养基的基础上,利用单因素方法确定培养最佳条件为:接种量为4%,温度为37 ℃,初始pH为7.0,静置培养。此时该菌株的活菌数可达到7.13×1010cfu/mL,是未优化前的10.7倍。

罗伊氏乳杆菌,高密度培养,优化,培养基成分,响应面法

近年来,随着人们健康意识的逐渐增强,益生菌及其制品已成为人们争相研究的热点,也是以后食品开发的重点[1],但益生菌自身特殊的生长条件,对其进入市场的益生菌的成活率有一定的影响[2]。我国许多大型乳品企业都采用国外进口的先进设备,其生产易行、质量稳定,但生产成本较高[3-5],为适应市场需求,不仅要提高益生菌的活菌数,还要降低成本,因此,高密度培养是益生菌制备的关键技术[6-8]。

罗伊氏乳杆菌作为一种常见的益生菌,是人体肠道中重要的微生物,与人的身体健康息息相关[9]。同时它也是我国允许应用于保健食品的菌株。对人体消化道中有益、中性和有害微生物之间的平衡都有很好的益生功能[10-13]。本研究的罗伊氏乳杆菌LT018分离自巴马128岁老人粪便样品,是一株来源明晰、特性鲜明,且具有多种潜在益生功能的菌株,具有较强的耐受模拟胃肠液、粘附繁殖及抑菌能力[14],为了展现出其价值,需要将其大量生产转化成产品。

将益生菌进行高密度培养,是其能应用到生产实际的关键[15]。高密度培养可以缩小培养体积,简化生产工艺,减少设备投资,降低生产成本,缩短生长周期,从而提高其在生产过程中的竞争力[16]。国内外对乳杆菌的高密度培养都十分重视,如对唾液乳杆菌[17]、德式乳杆菌[18]、植物乳杆菌[19]、干酪乳杆菌[20]、嗜酸乳杆菌[21]、枯草芽孢杆菌[22]等培养方面做了大量的研究,但对罗伊式乳杆菌的研究较少,王志林等[23]采用恒定pH分批培养方式高密度培养罗伊氏乳杆菌,最终发酵液中细胞密度达 3.1×109CFU/mL,Krauter等[24]采用补料分批发酵方式培养罗伊氏乳杆菌,生物量比分批培养增加1倍。本文拟对影响罗伊氏乳杆菌生长的营养条件和环境条件进行研究,以TPY为基础培养基,通过添加不同因素对比筛选出最适合生长的培养条件,尽可能提高菌体的活菌数,为益生菌食品的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株:罗伊氏乳杆菌(LactobacillusreuteriLT018),由本实验室提供。

TPY培养基:酪蛋白10 g,大豆蛋白胨5 g,酵母粉2 g,葡萄糖5 g,L-半胱氨酸0.5 g,K2HPO42 g,MgCl20.5 g,ZnSO40.25 g,CaCl20.15 g,FeCl30.001 g,吐温80 1 g,蒸馏水1 L,pH6.5,121 ℃灭菌20 min。

TPY固体培养基:在TPY液体培养基中加入15 g/L琼脂,用于罗伊氏乳杆菌的活化和平板活菌计数。

增殖培养基:按照实验设计配方配制,121 ℃灭菌20 min。

葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉 天津市科密欧化学试剂有限公司;牛肉膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白、酵母粉、柠檬酸铵、吐温80、L-半胱氨酸 北京奥博星生物技术有限公司;黄瓜、西红柿和胡萝卜 广西大学西菜市场。

MQD-B3R三层叠加式组合摇床 上海旻泉仪器有限公司;HR2826榨汁机 飞利浦集团;ZHTY-50F型恒温振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司;BL310电子天平 Sartorius公司;LDZX-50FBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 罗伊氏乳杆菌LT018经TPY固体培养基活化传代两次,挑取单菌落至TPY液态培养基中(50 mL培养基/250 mL三角瓶),根据实验设计,以设定的接种量接种至所设置培养基中,在设定的条件下培养后,测定其活菌数。

1.2.2 活菌数测定 10倍梯度稀释培养后的发酵液,取100 μL最高梯度稀释液涂布于TPY琼脂培养基,37 ℃培养24 h,计数。

1.2.3 培养基成分确定 以TPY培养基为基础培养基,固定除碳源以外的因素,选择葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘油和可溶性淀粉6种碳源分别加入培养基中,培养后测定活菌数,分析不同碳源对菌株生长的影响,并确定最佳碳源。同理,确定氮源(酵母粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨和柠檬酸铵)、缓冲盐(KH2PO4-NaOH、Na2HPO4-NaH2PO4、Na2HPO4-KH2PO4、Na2HPO4-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸钠-乙酸钠-K2HPO4)及生长因子(西红柿汁、胡萝卜汁、黄瓜汁、吐温80和L-半胱氨酸)。其中,生长因子中汁类制备如下:取新鲜蔬菜100 g,切碎加入适量蒸馏水煮沸10 min后,移入榨汁机中反复榨汁,纱布过滤,定容到200 mL。

1.2.4 培养基成分优化实验设计

1.2.4.1 Plackett-Burman实验设计 为了获得能够显著影响罗伊氏乳杆菌LT018生长的因素。将确定的培养成分:胰蛋白胨(A)、酵母粉(B)、麦芽糖(C)、柠檬酸(D)、柠檬酸钠(E)、西红柿汁(F)和L-半胱氨酸(G)等7个因素作为考察对象。采用Plackett-Burman实验设计[25],以罗伊氏乳杆菌的活菌数为响应值,筛选出影响因素。

1.2.4.2 最陡爬坡实验设计 根据Plackett-Burman实验设计得到的回归系数,来决定显著因素的最陡爬坡实验[26]的方向和梯度,从而确定实验因素的中心点。

表1 Plackett-Burman实验设计筛选各因素及水平Table 1 Screening Factors and levels of Plackett-Burman Design

注:a单位为mL/L。

1.2.4.3 Box-Behnken Design实验设计 根据确定的实验因素和中心点,采用Design-Expert软件进行响应面优化[27],以获得响应变量与各因素变量关系的二次多项回归拟合方程。根据方程计算得到罗伊氏乳杆菌LT018最佳增殖培养基配方。

表2 Box-Behnken Design因素水平及编码Table 2 Factor levels and coding of Box-Behnken Design

图1 不同营养物质对罗伊氏乳杆菌LT018活菌数的影响Fig.1 Effects of different nutrient substance on the viable cell counts of L.reuteri LT018注:*个数不同代表数据间有显著差异(p<0.05)。

1.2.4.4 验证实验 采用1.2.4.3响应面设计得到的增值培养基配方,进行罗伊氏乳杆菌LT018培养,培养结果与模型的响应预测值进行对比。

1.2.5 培养条件优化实验 在1.2.4优化出的最优培养基的基础上,设定罗伊氏乳杆菌LT018的接种量为1%、2%、3%、4%、5%、6%,培养温度为23、28、33、37、42 ℃,初始pH为5.6、6.0、6.4、6.7、7.0、7.4,摇床转数为0、50、100、150、200 r·min-1,通过对比培养后罗伊氏乳杆菌LT018的活菌数大小,确定LT018的最佳培养条件。

1.2.6 对比实验 将活化好的菌种液分别接种至初始条件下(接种量:2%,温度:37 ℃,初始pH:6.5,转速:0 r/min)TPY培养基、初始条件下增殖培养基和1.2.5培养条件下增殖培养基中,培养后对比活菌数。

1.2.7 数据分析 采用Design Expert8.0.6设计软件进行Plackett-Burman和响应面设计分析;采用SPSS v.19.0数据软件和Origin8.5进行数据分析和作图。

2 结果与分析

2.1 培养基成分确定

乳酸菌的种类差异,甚至株水平的差异,都会存在其所需的营养成分不同的现象,因此需要根据实际情况进行选择。本研究通过对培养基的碳源、氮源、缓冲盐和生长因子对活菌数的影响作用进行比较,筛选显著影响菌株LT018的营养成分,结果如图1所示。

由图1可知,对罗伊氏乳杆菌LT018生长有显著(p<0.05)促进作用的碳源是麦芽糖,氮源是胰蛋白胨,缓冲体系是柠檬酸-柠檬酸钠,生长因子是西红柿汁和L-半胱氨酸。菌株的生长对氮源的需求比较高,大豆蛋白胨和胰蛋白胨为同一类型氮源,所以综合考虑选择胰蛋白胨和酵母粉作为其生长的复合氮源。因此,本实验将罗伊氏乳杆菌LT018的培养基成分选定为:麦芽糖、胰蛋白胨、酵母粉、柠檬酸、柠檬酸钠、西红柿汁和L-半胱氨酸。

2.2 Plackett-Burman实验设计及结果

以上述实验结果选定的培养基成分为因素进行Plackett-Burman实验设计,实验设计因素及水平见表1和实验结果见表3。

表3 Plackett-Burman实验设计各因素 对LT018活菌数的影响Table 3 Effects of various factors of PB Design on the viable cell counts of LT018

由表3可知,不同实验设计水平下罗伊氏乳杆菌LT018的活菌数有一定差异。利用Design Expert软件对表3中的实验结果进行方差分析,结果如表3所示。

表4 Pclakett-Burman实验设计方差分析表Table 4 ANOVA for Plackett-Burman Design

注:*表示在p<0.05水平上,结果显著。 由表4可知,胰蛋白胨、淀粉、西红柿汁和L-半胱氨酸对活菌数的影响为正效应(回归系数皆为正)。即随着基础培养基中这四种成分含量的增加,活菌数呈上升趋势;其余系数为负,均为负效应。其中胰蛋白胨、柠檬酸和L-半胱氨酸的p均小于0.05,表明这三种成分显著影响罗伊氏乳杆菌LT018在基础培养基中的增殖。则选择以胰蛋白胨、柠檬酸和L-半胱氨酸这三种成分为主要研究对象做后续研究,采用最陡爬坡实验确定三种成分的最佳浓度范围。

2.3 最陡爬坡实验设计

依照上述实验结果,保持除胰蛋白胨、柠檬酸和L-半胱氨酸以外的水平不变,对这三种成分进行最陡爬坡实验,其实验设计和结果见表5。

表5 最陡爬坡实验设计及结果Table 5 Test design and results of the steepest ascent

由表5可知,采用最陡爬坡实验可以快速逼近最佳区域[28],由回归系数可知其中与柠檬酸呈负相关,与胰蛋白胨和L-半胱氨酸呈正相关,所以随着柠檬酸的含量降低,胰蛋白胨和L-半胱氨酸的含量增高,菌株的活菌数呈先上升后下降的变化趋势。在3实验条件(胰蛋白胨:12 g/L;柠檬酸:0.39 g/L;L-半胱氨酸:0.6 g/L)下,活菌数达到最大,为6.33×1010cfu/mL,则以此种组合作为响应面设计的中心点进行后续优化实验。

2.4 Box-Behnken Design响应面设计

依照2.2和2.3实验确定的显著影响因素和实验因素中心点,利用Design Expert软件进行三因素三水平的响应面设计。其各因素水平及编码见表2,实验设计及结果见表6,方差分析结果见表7。

表6 Box-Behnken实验设计及结果Table 6 Test design and rusults of Box-Behnken

表7 响应面二次方模型方差分析Table 7 Analysis of variance table for response surface quadratic model

图2 各因素交互作用响应曲面图Fig.2 Response surface plot of interactive effects of various factors

注:**表示在p<0.01水平上,结果显著。通过对实验数据进行二项式回归拟合,得到罗伊氏乳杆菌LT018活菌数对胰蛋白胨、柠檬酸和L-半胱氨酸的二次多项式方程为:

Y(×1010cfu/mL)=64.6+1.29X1+3.54X2-0.42X3-0.92X1X2-0.66X1X3+1.16X2X3-4.01X12-6.51X22-3.76X32

式中:Y为预测响应值,X1为胰蛋白胨的编码值,X2为柠檬酸的编码值,X3为L-半胱氨酸的编码值。

由方程可知,二次项系数估计值均为负值,说明该模型具有最大值。由方程计算可得Y的最大估计值为6.52×1010cfu/mL,此时胰蛋白胨含量为12.13 g/L,柠檬酸0.4 g/L,L-半胱氨酸0.6 g/L。

2.5 验证实验

罗伊氏乳杆菌LT018经模型预测最优培养基培养后,进行模拟实验,其条件为:胰蛋白胨含量为12.13 g/L,柠檬酸0.4 g/L,L-半胱氨酸0.6 g/L,酵母粉5 g/L,麦芽糖20 g/L,西红柿汁100 g/L,柠檬酸钠5.5 g/L。据此测得实际活菌数为6.43×1010cfu/mL,与响应预测值拟合率为98.74%,说明由回归方程得到的优化培养基各因素参数准确可靠,有一定的实用价值。

2.6 培养条件优化

在LT018优化培养基成分的基础上,对4种培养条件进行优化,结果如表8所示。

由表8可知,不同接种量、温度、初始pH对罗伊氏乳杆菌LT018生长影响均有差异,其中活菌数随接种量、温度、初始pH增大先升高后降低,随转速升高显著降低。据此选择培养条件:接种量为4%,温度为37 ℃,初始pH为7.0,静置培养。

2.7 对比实验

罗伊氏乳杆菌LT018在初始条件下TPY培养基、初始条件下增殖培养基和优化培养条件下增殖培养基的活菌数分别为6.67×109、6.43×1010和7.13×1010cfu/mL,通过培养基成分优化,使活菌数与在TPY液体培养基中培养相比增大了9.6倍,通过培养条件的优化,又使活菌数增大了1.1倍,最终与在TPY液体培养基中培养相比共增加10.7倍。目前研究报道的乳酸杆菌高密度培养结果普遍较低,如发酵乳杆菌和唾液杆菌在优化碳源氮源生长因子缓冲盐等因素经过高密度培养后活菌数分别达到8.23×109cfu/mL和5.94×109cfu/mL,较基础培养基分别提高了4.78倍和3倍[29-30],但均低于本研究结果,说明本研究高密度培养策略得当,也凸显出菌株LT018的快速繁殖潜力,为该菌株今后益生菌产品的开发提供了重要理论指导。

表8 不同培养条件对LT018活菌数的影响Table 8 Effects of different condition of cultivate on the viable cellcounts of LT018

3 结论

本研究对罗伊氏乳杆菌LT018进行高密度培养,通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验设计和Box-Behnken Design响应面设计确定培养基为:胰蛋白胨含量为12.13 g/L,柠檬酸0.4 g/L,L-半胱氨酸0.6 g/L,酵母粉5 g/L,麦芽糖20 g/L,西红柿汁100 mL/L,柠檬酸钠5.5 g/L。在接种量为4%,温度为37 ℃,初始pH为7.0的静置条件下,培养24 h得到菌体浓度为7.13×1010cfu/mL,远高于普通培养。

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Research of growth factors in high cell-density culture ofLactobacillusreuteriLT018

LIU Dong1,HU Ya-min2,LIU Hong-ji1,ZHU Zhen-jun1,LI Quan-yang1，*

(1.College of Light Industry and Food Engineering,Guangxi University,Nanning 530004,China;2.The first secondary school of Tai’an in Shandong Province,Tai’an 271000,China)

Lactobacillus reuteriLT018whichseparatedfromthefaecesofcentenarianslivinginBamaisanexcellentprobiotic.Inordertoachieveitshighcell-densitygrowth,inthisstudy,onthebasisofTPYfermentation,acertainfermentationcomponentsoftheLT018wasdevelopedthroughsinglefactor,whichcouldbeillustratedasfollows:tryptone,yeastpowder,maltsugar,citricacid,sodiumcitrate,tomatojuiceandL-cysteine.ThePlackett-Burmanexperimentwasusedtofindthattryptone,citricacidandL-cysteinehadsignificantimpactonprobiotic’sgrowth,thensteepestascentwasdesignedtoapproachoptimumareafast,andtheresponsesurfaceanalysiswasusedtooptimizethecombinationofsignificantfactor,andtheoptimumconditionsweretryptoneof12.13g/L,citricacidof0.4g/L,L-cysteineof0.6g/L.Underthiscondition,thecultureconditionswasdeterminedasfollows:4%ofinocula,37 ℃,initialpH6.7andstaticallycultured.TheresultshowedthattheviablecountofLT018was7.13×1010cfu/mL,whichwas10.7timesthatofthecountbeforeoptimization.

Lactobacillus reuteri;highcell-densityculture;optimization;mediumcomponents;responsesurfacemethod

2016-05-12

刘栋(1991-)，男，硕士研究生，研究方向：食品营养与健康长寿，E-mail:15578951780@163.com。

*通讯作者:李全阳(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品营养与健康长寿,E-mail:liquanyang@gxu.edu.cn。

国家自然科学基金面上项目(31371762)；乳业生物技术国家重点实验室开放基金项目(SKLDB2013-07)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)21-0144-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.020