凝结芽孢杆菌Liu-g1产中性蛋白酶的发酵培养基及条件优化

张营营,郭 茜,熊利霞,张红星,谢远红,刘 慧,*,梁新贝,连正兴

(1.北京农学院食品科学与工程学院,微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室,食品质量与安全北京实验室,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室,北京 102206;2.中国农业大学动物科技学院,北京 100094)



凝结芽孢杆菌Liu-g1产中性蛋白酶的发酵培养基及条件优化

张营营1,郭 茜1,熊利霞1,张红星1,谢远红1,刘 慧1,*,梁新贝1,连正兴2

(1.北京农学院食品科学与工程学院,微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室,食品质量与安全北京实验室,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室,北京 102206;2.中国农业大学动物科技学院,北京 100094)

为提高一株产中性蛋白酶凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)Liu-g1发酵液中蛋白酶活力,采用单因素和正交实验研究不同培养基配方和不同发酵条件对凝结芽孢杆菌Liu-g1产中性蛋白酶活力的影响。结果表明:发酵培养基最优配方为大豆粕1%、玉米淀粉4%、碳酸钙0.6%;在初始pH7.5,装液量30 mL/250 mL,发酵温度45 ℃,发酵时间72 h优化条件下发酵液中蛋白酶活力最高,可达243.874 U/mL,为优化前的5.8倍。

凝结芽孢杆菌,中性蛋白酶活力,发酵,优化

凝结芽孢杆菌具有乳酸菌产乳酸和芽孢杆菌耐高温、抗逆性强、稳定性好的储存特性,以及具有丰富的胞外酶系统,作为一种独特的新型芽孢益生菌,被国内外学者研究并应用于医药、食品、保健、畜牧和水产品养殖等行业[1-5]。匡群等[6]研究发现投喂凝结芽孢杆菌后的团头鲂鱼的生长率和蛋白质利用率均显著提高,料肉比和肠道大肠杆菌数量显著降低;曾丽莉等人[7]研究显示饲料中添加适量的凝结芽孢杆菌可明显改善樱桃谷肉鸭的生长性能和生化指标;林丽花等人[8]在饲粮中添加200 mg/kg凝结芽孢杆菌菌粉(1×109CFU/g)可显著提高黄羽肉鸡日增重、胸肌率和成活率,显著降低了全期肉鸡的料肉比。诸多动物实验中凝结芽孢杆菌体现出提高日增重、降低料肉比的效果,在很大程度上得益于其分泌的丰富胞外酶。凝结芽孢杆菌进入机体定植于肠道后,一方面产生大量蛋白酶[9]、脂肪酶[10]等,促进畜禽对营养物质的消化吸收;另一方面菌株代谢产生的氨基酸、维生素、短链脂肪酸、促生长因子等可供动物机体利用[11],从而促进畜禽的生长。虽然凝结芽孢杆菌在优化发酵条件以获得大量菌体或芽孢方面研究颇多,但是在优化发酵条件以提高中性蛋白酶活力方面研究甚少。本文利用筛选自传统干酪的凝结芽孢杆菌Liu-g1,采用单因素和正交实验研究不同培养基配方和不同发酵条件对菌株Liu-g1产中性蛋白酶活力的影响,优化凝结芽孢杆菌Liu-g1产中性蛋白酶的发酵条件,为工业化生产中性蛋白酶奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株 凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)Liu-g1:筛选于传统干酪,经前期实验鉴定为产中性蛋白酶的菌株。保藏地址:中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。

基础培养基[12]:葡萄糖1%、蛋白胨1%、氯化钠0.4%,pH7.0。

干酪素、L-酪氨酸 国药集团化学试剂北京有限公司;福林试剂 Sigma试剂公司;其它发酵培养基试剂均为分析纯 北京陆桥技术责任有限公司。

BS224S型精密电子天平 德国赛多利斯集团;MLS-3750型全自动高压蒸汽灭菌锅 日本SANYO公司;BCN-1360B型无菌超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司;2100型可见光分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂;雷磁PHS-3B型pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化及扩培 凝结芽孢杆菌Liu-g1以2%的接种量移种于装有10 mL基础培养基的试管中,于37 ℃在转速为150 r/min的摇床培养48 h。如此活化培养2代,得到活化菌种。将活化菌液以2%接种量移种于基础培养基中(50 mL/250 mL),培养条件同上,得到扩大培养液[13]。

1.2.2 单因素实验确定发酵培养基配方

1.2.2.1 碳源的确定 将基础培养基中的碳源分别由1%葡萄糖、蔗糖、纤维素、可溶性淀粉、玉米淀粉、麦芽糖替代,将扩培菌液以2%接种量移种于基础培养基中(50 mL/250 mL),于150 r/min的摇床37 ℃培养48 h,8000 r/min离心10 min,取上清测定发酵液中蛋白酶活力,根据酶活力大小分析确定较好的碳源。

1.2.2.2 氮源的确定 在确定较好碳源的基础上,将基础培养基中的氮源分别由1%花生麸皮、大豆粕、棉籽粕、玉米麸皮、小麦麸皮替代[14],以上述同样条件发酵后8000 r/min离心10 min,取上清测定发酵液中蛋白酶活力,根据酶活力大小分析确定较好的氮源。

1.2.2.3 无机盐的确定 在确定较好碳源和氮源的基础上,将基础培养基中的无机盐分别由0.4%氯化钠、氯化钙、碳酸钙、硫酸镁、硫酸锰、K2HPO4∶KH2PO4=1∶1替代,以上述同样条件发酵后8000 r/min离心10 min,取上清测定发酵液中蛋白酶活力,根据酶活力大小分析确定较好的无机盐。

1.2.3 正交实验优化发酵培养基配方 根据上述单因素多水平实验结果,选择质量分数分别为1%、2%、4%的大豆粕,1%、2%、4%的玉米淀粉,0.2%、0.4%、0.6%的碳酸钙设计凝结芽孢杆菌Liu-g1产中性蛋白酶发酵培养基的三因素三水平[L9(34)]正交实验,因素水平表见表1。以上述同样条件发酵后8000 r/min离心10 min,取上清测定发酵液中蛋白酶活力,根据酶活力大小分析确定优化培养基配方。

表1 优化发酵培养基正交因素水平表Table 1 Orthogonal factors level table for the optimization of medium components for Bacillus coagulans Liu-g1

1.2.4 单因素实验确定发酵条件

1.2.4.1 发酵装液量的确定 采用经上述优化好的培养基配方,250 mL三角瓶中装液量分别为30、40、50、60、70 mL,以上述同样条件发酵后8000 r/min离心10 min,取上清测定发酵液中蛋白酶活力,根据酶活力大小分析确定较好装液量。

1.2.4.2 发酵转速的确定 采用上述较好发酵装液量,转速分别为140、160、180、200、220 r/min,以上述同样条件发酵后8000 r/min离心10 min,取上清测定发酵液中蛋白酶活力,根据酶活力大小分析确定较好转速。

1.2.4.3 发酵接种量的确定 采用上述较好发酵装液量、转速,接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%,以上述同样条件发酵后8000 r/min离心10 min,取上清测定发酵液中蛋白酶活力,根据酶活力大小分析确定较好接种量。

1.2.4.4 发酵pH的确定 采用上述较好发酵装液量、转速、接种量,初始培养基pH分别调节为6.5、7、7.5(自然)、8,以上述同样条件发酵后8000 r/min离心10 min,取上清测定发酵液中蛋白酶活力,根据酶活力大小分析确定较好pH。

1.2.4.5 发酵时间的确定 采用上述较好发酵装液量、转速、接种量、初始pH7,发酵时间分别为12、24、36、48、60 h,以上述同样条件发酵后8000 r/min离心10 min,取上清测定发酵液中蛋白酶活力,根据酶活力大小分析确定较好发酵时间。

1.2.4.6 发酵温度的确定 采用上述较好发酵装液量、转速、接种量、初始pH7、发酵时间48 h,发酵温度分别为37、41、45、50、55 ℃,以上述同样条件发酵后8000 r/min离心10 min,取上清测定发酵液中蛋白酶活力,根据酶活力大小分析确定较好发酵温度。

1.2.5 正交实验优化发酵条件 根据上述单因素多水平实验结果,选择6.5、7、7.5初始培养基pH,30、45、60 mL装液量,37、41、45 ℃发酵温度,48、60、72 h发酵时间设计四因素三水平[L9(34)]正交实验,以上述同样条件发酵后8000 r/min离心10 min,取上清测定发酵液中蛋白酶活力,根据酶活力大小分析确定优化发酵条件。正交因素水平表如下:

表2 优化发酵条件正交因素水平表Table 2 Orthogonal factors level table for the optimization of fermentation conditions for Bacillus coagulans Liu-g1

1.2.6 蛋白酶活力测定 参照国家标准GB/T23527—2009《蛋白酶制剂》,采用福林-酚法测定中性蛋白酶活力[15]。

1.2.7 数据处理方法 使用SPSS 22.0软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验确定发酵培养基配方

2.1.1 碳源的确定 碳源即为微生物提供碳素来源的营养物质,主要生理功能是构成微生物细胞物质和代谢产物[16]。由图1可见,以纤维素为碳源时发酵液有较高的蛋白酶活力,说明该菌能够分泌纤维素酶;当玉米淀粉为碳源时蛋白酶活力极显著(p<0.01)高于其他碳源,为181.552 U/mL。这是由于玉米淀粉为迟效碳源,有利于菌体在稳定期合成蛋白酶,而葡萄糖、蔗糖、麦芽糖为速效碳源,有利于菌体生长,但不利于代谢产物的合成。因此确定玉米淀粉为Liu-g1菌株发酵培养基碳源。

图1 发酵培养基碳源对中性蛋白酶活力的影响Fig.1 Effect of carbon source on neutral proteinase activity

2.1.2 氮源的确定 氮源是组成微生物细胞中蛋白质和核酸的重要成分。由图2可知,五种不同的有机氮源条件下,Liu-g1菌株产中性蛋白酶活力差异明显。以玉米麸皮和小麦麸皮为氮源时产蛋白酶活力极低;以大豆粕为氮源时产蛋白酶活力极显著(p<0.01)高于花生麸皮,达161.513 U/mL,棉籽粕次之,为125.949 U/mL。因此确定豆粕为Liu-g1菌株发酵培养基氮源。

图2 发酵培养基氮源对中性蛋白酶活力的影响Fig.2 Effect of nitrogen source on neutral proteinase activity

图3 发酵培养基无机盐对中性蛋白酶活力的影响Fig.3 Effect of inorganic salts on neutral proteinase activitty

2.2 正交实验优化发酵培养基配方

由表3可见RA>RB>RC,即影响Liu-g1菌株发酵液中蛋白酶活力的因素主次顺序依次为:碳源含量、氮源含量、无机盐含量;由KA1>KA2>KA3,KB3>KB1>KB2,KC3>KC2>KC1可知,发酵培养基配方最优组合为A1B3C3,即碳源含量为1%,氮源含量为4%,无机盐含量为0.6%,碳源∶氮源=1∶4。

表3 优化培养基条件[L9(34)]正交实验结果Table 3 Orthogonal array design and results for the optimization of medium components for Bacillus coagulans Liu-g1

2.3 单因素实验确定发酵条件

2.3.1 发酵装液量的确定 由图4可知,装液量在30 mL/250 mL时发酵液蛋白酶活力最高,达到186.048 U/mL。发酵装液量是发酵环境中溶氧量的间接体现,凝结芽孢杆菌为兼性厌氧菌,虽然缺氧乃至无氧条件下也可生存,但富氧环境有利于菌体的快速大量繁殖,足够多的菌体富集因而能产生更多的蛋白酶。因此确定Liu-g1菌株发酵装液量为30 mL/250 mL。

图4 发酵装液量对中性蛋白酶活力的影响Fig.4 Effect of fermentation volume on neutral proteinase activity

图5 发酵转速对中性蛋白酶活力的影响Fig.5 Effect of revolving speed on neutral proteinase activity

2.3.2 发酵转速的确定 由图5可知,发酵转速对于发酵液中蛋白酶活力影响不大,转速在140～220 r/min时发酵液蛋白酶活力先升高后降低,转速在180 r/min时,发酵液蛋白酶活力最高。在一定范围内,转速的提高可以增加发酵液中溶氧量,从而促进菌体生长和蛋白酶累积;然而当转速超过180 r/min时,过高转速开始不利于菌体的稳定繁殖,从而降低发酵液中蛋白酶活力。由此确定Liu-g1菌株发酵转速为180 r/min。

2.3.3 发酵接种量的确定 由图6可见,随发酵接种量的逐渐增加发酵液中蛋白酶活力呈现不规则跳跃,在接种量为5%时,发酵液蛋白酶活力最高,达143.869 U/mL。不同接种量水平对蛋白酶活力的影响差异不显著。因此确定Liu-g1菌株发酵接种量为5%。

图6 发酵接种量对中性蛋白酶活力的影响Fig.6 Effect of inoculation amount on neutral proteinase activity

2.3.4 发酵pH的确定 pH通过影响菌体营养物质离子化程度、细胞膜电荷及膜渗透性,影响菌体对养分的吸收[17]。由图7可知,初始pH在6.5～8.0时,发酵液中蛋白酶活力呈现先上升后下降趋势,当pH为7.0时,发酵液中蛋白酶活力最高,达180.523 U/mL。因此确定Liu-g1菌株发酵液初始pH为7.0。

图7 发酵液pH对中性蛋白酶活力的影响Fig.7 Effect of initial pH on neutral proteinase activity

2.3.5 发酵时间的确定 由图8可知,发酵时间为24 h和36 h时发酵液中蛋白酶活力极低,48 h时明显升高,之后缓慢提高,发酵72 h的发酵液中蛋白酶活力极显著(p<0.01)高于其他发酵时间组。这是由于发酵36 h之前Liu-g1菌株处于生长对数期,而菌体蛋白酶一般在稳定期合成。考虑发酵周期和成本因素,发酵时间选择72 h。

图8 发酵时间对中性蛋白酶活力的影响Fig.8 Effect of fermentation time on neutral proteinase activity

表5 发酵条件优化前后产中性蛋白酶活力对照Table 5 Comparison of neutral protease activity before and after optimization of fermentation conditions

2.3.6 发酵温度的确定 发酵温度对蛋白酶合成及其活力有较大影响。由图9可知,温度在35～45 ℃时,发酵液蛋白酶活力逐渐升高;当温度为45 ℃时,发酵液蛋白酶活力最高,说明45 ℃为蛋白酶最适合成温度;当高于45 ℃时发酵液蛋白酶活力逐渐降低,这缘于较高的温度会导致蛋白酶活力降低。因此确定Liu-g1菌株发酵温度为45 ℃。

图9 发酵温度对中性蛋白酶活力的影响Fig.9 Effect of fermentation temprature on neutral proteinase activity

2.4 正交实验优化发酵条件

由表4可见RD>RC>RB>RA,即影响Liu-g1菌株发酵液中蛋白酶活力的因素主次顺序依次为:发酵时间、装液量、发酵温度、初始pH;由KA3>KA2>KA1,KB1>KB2>KB3,KC3>KC2>KC1,KD3>KD2>KD1可知,发酵条件最优组合为A3B1C3D3,即初始pH7.5,装液量30 mL/250 mL,发酵温度45 ℃,发酵时间72 h。

表4 优化发酵条件L9(34)正交实验结果Table 4 Orthogonal array design and results for the optimization of fermentation conditions for Bacillus coagulans Liu-g1

2.5 验证实验

由表5可知,对照组凝结芽孢杆菌Liu-g1蛋白酶活力为42.106 U/mL,优化发酵条件下Liu-g1菌株发酵液中蛋白酶活力可达243.874 U/mL,为优化前的5.8倍。

3 结论

本文通过单因素和正交实验优化凝结芽孢杆菌Liu-g1产中性蛋白酶的发酵培养基配方为:大豆粕1%、玉米淀粉4%、碳酸钙0.6%;优化发酵条件为:初始pH7.5,装液量30 mL/250 mL,发酵温度45 ℃,发酵时间72 h。在优化发酵条件下中蛋白酶活力可达243.874 U/mL,为优化前的5.8倍。

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Optimization of culture medium and fermentation conditions for neutral protease produced byBacilluscoagulansLiu-g1

ZHANG Ying-ying1,GUO Qian1,XIONG Li-xia1,ZHANG Hong-xing1,XIE Yuan-hong1,LIU Hui1,*,LIANG Xin-bei1,LIAN Zheng-xing2

(1.Food Science and Engineering College,Beijing University of Agriculture,Beijing Engineering Laboratory of Probiotics Key Technology Development,Food Quality and Safety Lab in Beijing,Harmful Microorganisms and Pesticide Safety Inspection of Agricultural Products and the Control of the Beijing Key Laboratory,Beijing 102206,China;2.College of Animal Science and Technology,China Agricultural University,Beijing 100094,China)

InordertoimprovetheactivityofneutralproteaseproducedbyBacillus coagulansLiu-g1,singlefactortestandorthogonaltestonBacillus coagulansLiu-g1proteaseactivitywerecarriedout.Theresultsshowedthattheoptimalculturemediumformulawas1%ofsoybeanpowder,4%ofcornstarchand0.6%ofcalciumcarbonate.TheresultsalsoindicatedthatthebestinitialpHwas7.5,fermentationvolumeof30mL/250mL,incubationtemperatureat45 ℃,fermentationtimefor72h.Theproteaseactivityreached243.874U/mLinsuchconditions,5.8timestheamountofinitialconditions.

Bacillus coagulans;neutralproteaseactivity;fermentation;optimization

2016-05-30

张营营(1990-)，女，硕士，研究方向：食品微生物，E-mail：18811300700@163.com。

*通讯作者:刘慧(1963-)，女，硕士，教授，研究方向：食品微生物与发酵，E-mail：mxdlh1963@163.com。

转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08008-005)；北京市属高等学校高层次人才引进与培养项目(CIT&TCD20140315)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)21-0150-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.021