响应面法优化海地瓜皂苷提取工艺

苏永昌,刘淑集,阮伟达,刘秋凤,王 茵,刘智禹

(1.福建省水产研究所,国家海水鱼类加工技术研发分中心(厦门),福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室,福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心,福建厦门 361013;2.福建省南安市疾病预防控制中心,福建南安 362300)



响应面法优化海地瓜皂苷提取工艺

苏永昌1,刘淑集1,阮伟达2,刘秋凤1,王 茵1,刘智禹1

(1.福建省水产研究所,国家海水鱼类加工技术研发分中心(厦门),福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室,福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心,福建厦门 361013;2.福建省南安市疾病预防控制中心,福建南安 362300)

目的:以海地瓜为原料,开展了海地瓜皂苷的提取工艺研究。方法:在单因素分析的基础上,采用了响应面法分析了乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间等因素对海参皂苷得率的影响,优化获得最佳的海地瓜皂苷提取工艺为:乙醇浓度为79%,提取温度为73.5 ℃,提取时间为2.75 h,料液比为1∶1.7 g/mL。对海地瓜皂苷的影响由大到小依次为乙醇体积、乙醇浓度、提取时间和提取温度。在该工艺下提取海地瓜皂苷得率为0.378%。与模型预测值一致。结论:响应面分析法确定的提取条件合理,验证值与预测值接近,可以用于海地瓜皂苷的提取工艺优化。

海地瓜,皂苷,提取工艺,响应面法

海参皂苷,又被称海参皂甙、海参毒素,是一类由苷元与糖链结合而成的化合物,大多结构属于羊毛甾醇型三萜类寡糖苷[1-2]。海参皂苷,能溶于水、稀醇、热甲醇和乙醇中,难溶于丙酮、乙醚、苯等亲脂性的有机试剂[3]。目前,海参皂苷的提取方法主要有醇-醇提取法[4-5]、水-醇提取法[6]、冷浸提法[7-8]和水提取法[9-10]。研究证明,海参皂苷具有溶血作用[11]、抗肿瘤[10]、提高免疫力[12]、抗菌[9]、抗病毒[13]、镇痛解痉的作用[14]、抑制排卵和刺激子宫收缩的作用[15]、降血脂[16]等多种生物活性。

海地瓜(AcaudinaMolpadioides)俗称香参、白参、海茄子,属芋参目(Molpadida)尻参科(Caudinidae)海地瓜属(Acaudina)动物[17],在我国海南、广东、福建和浙江沿海等地广泛分布[18]。海地瓜作为低值海参,具有价格低廉,产量大,可大规模开发利用的特点。海地瓜营养丰富,含有皂苷、多糖、胶原蛋白等多种生物活性物质物质[19],显示出了巨大的开发潜力和市场价值。目前,应用乙醇进行海参皂苷的浸提应用最为广泛,具有溶解性高、操作简便,试剂毒性低的特点[20]。本研究应用响应面法对乙醇浸提海地瓜皂苷的工艺条件进行优化,获得了简便高效的海地瓜提取工艺,提高了海地瓜皂苷的得率,为海地瓜皂苷的规模化开发利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海参原料 海地瓜采集于福建宁德海域,新鲜原料洗净后绞碎,测定水分含量后,冷冻备用;皂苷标准品:人参皂苷Re(色谱纯) 中国药检所;香草醛、甲醇等均为国产分析纯试剂。

RE52型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;AL204型电子天平 瑞士梅特勒公司;DK-8B 型恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;BSA224S分析天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司;M200 PRO多功能酶标仪 瑞士Tecan公司。

1.2 实验方法

采用乙醇浸提法对海地瓜皂苷进行提取,称量海地瓜100 g,加入不同浓度乙醇、在设定的恒温条件下,进行浸泡提取皂苷,浸提液经低温浓缩和冷冻干燥,制备获得海地瓜皂苷粗品。参照香草醛法进行海地瓜皂苷粗品中皂苷含量[21],以海地瓜原料干重计算海地瓜皂苷得率,计算方法如下:

海地瓜皂苷得率(%)=海地瓜皂苷含量(g)/海地瓜原料质量×(1-水分百分含量)(g)×100

1.2.1 单因素实验 乙醇浓度因素:在提取温度为70 ℃、提取时间3 h、提取次数3次、料液比1∶1.5 g/mL(W/V)的条件下,分别选择乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%进行皂苷提取。

料液比因素:在乙醇浓度为70%、温度为70 ℃、提取时间3 h、提取次数3次的条件下,分别选择1∶1、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5 g/mL(W/V)乙醇溶液的进行皂苷提取。

提取温度因素:在乙醇浓度为70%、提取时间3 h、提取次数3次、料液比1∶1.5 g/mL(W/V)的条件下,分别选择提取温度为50、60、70、80、90 ℃进行皂苷提取。

提取时间因素:在乙醇浓度为70%、提取温度为70 ℃、提取次数为3次、料液比1∶1.5 g/mL(W/V)的条件下,分别选择提取时间为2、3、4、5 h,进行皂苷提取。

提取次数因素:在乙醇浓度为70%、提取温度为70 ℃、提取时间为3 h、料液比1∶1.5 g/mL(W/V)的条件下提取,分别选择提取次数为1、2、3、4、5次,进行皂苷提取。

1.2.2 响应面实验因素设计 根据单因素实验结果,分别对乙醇浓度(A)、提取温度(B)、提取时间(C)和料液比(D)为自变量进行优化,以皂苷的得率(Y)为响应对象,根据Box-Behnken原理设计四因素三水平的实验因素水平表,如表1所示,对结果进行方差分析和响应面分析,获得最佳皂苷提取工艺。

表1 Box-Benhnken实验因素水平表Table 1 Box-Benhnken test factor-levels table

1.3 数据处理

采用Design-Expert 软件,并结合SAS数据处理软件对结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对海地瓜皂苷的影响 分别采用50%、60%、70%、80%、90%浓度乙醇作为溶剂进行海地瓜皂苷提取,结果如图1所示。海地瓜皂苷得率随着乙醇浓度的提高呈现先上升后下降的趋势,其中,采用70%乙醇进行提取时,皂苷得率达到最大值(p<0.05)。乙醇浓度过高或过低均不利于海地瓜皂苷的溶出,其原因可能是当乙醇浓度为50%时,皂苷成分不能有效溶解于浸提液中;当乙醇浓度大于90%后,水溶性的皂苷不能溶出,降低了皂苷的得率。因此,将乙醇浓度控制为60%～80%效果最佳。

图1 乙醇浓度对皂苷得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of saponins

2.1.2 料液比对海地瓜皂苷的影响 采用料液比为1∶1、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5 g/mL(w/v)对海地瓜皂苷进行提取,结果如图2所示。随着乙醇体积的提高,海地瓜皂苷得率呈现先上升,后略有下降的趋势,料液比为1∶2.0 g/mL(w/v)时,海地瓜皂苷得率达最高(p<0.05)。当浸提液比较少时,浸提液中溶液不足,原料内容物浸出率较低;当浸提液逐渐增大后,原料内容物浸出率增加,皂苷得率增加;当浸提液进一步增加后,皂苷得率反而下降,其原因可能为浸提液过多,造成后续操作如浓缩等环节时间加长,造成皂苷一定的损失。因此,综合考虑,料液比为1∶1.5～1∶2.5 g/mL为宜。

图2 料液比对皂苷得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of saponins

2.1.3 提取温度对海地瓜皂苷的影响 分别采用提取温度为50、60、70、80、90 ℃对海地瓜皂苷进行提取,结果如图3所示。海地瓜皂苷随着提取温度的提高呈现先上升,后下降的趋势。当提取温度为70 ℃时,皂苷的提取率为最大值(p<0.01)。提取温度对海地瓜内溶物的溶出效果影响显著,当提取温度为50 ℃时,提取液中内溶物溶出效果不明显,皂苷提取率较低;当温度逐渐上升后,提取液粘度不断增大,内溶物溶出效果明显;但提取温度过高时,一方面会造成原料溶出物过多,浸提液变粘稠,增加皂苷中的杂质含量,为皂苷的进一步纯化增加难度;另一方面可能会造成皂苷成分的破坏,因此,在温度达到90 ℃时,海地瓜皂苷的得率反而降低。因此,提取温度选择在60～80 ℃为宜。

图3 提取温度对皂苷得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of saponins

2.1.4 提取时间对海地瓜皂苷的影响 采用提取时间分别为2、3、4、5 h对海地瓜皂苷进行提取,结果如图4所示。海地瓜皂苷得率随提取时间的增加呈现先上升后略有下降的趋势。当提取时间为3 h后,皂苷的得率最高(p<0.05),表明在3 h左右皂苷溶出已达到平衡点,当提取时间大于3 h,延长提取时间对皂苷得率反而略有下降,可能是提取时间过长造成部分皂苷成分破坏。同时,提取时间过长会导致杂质溶出率增加,影响皂苷纯度。因此,提取时间不宜太长,以2～4 h为宜。

图4 提取时间对皂苷得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of saponins

2.1.5 提取次数对海地瓜皂苷的影响 采用提取次数分别为1、2、3、4、5次对海地瓜皂苷进行提取,结果如图5所示。提取次数对海地瓜皂苷得率具有较大影响,海地瓜皂苷得率随提取次数的增加而上升。当提取次数大于3次时,海地瓜皂苷提取率上升趋于平缓,表明将原料进行3次浸提后,基本完成可溶出皂苷的提取,当提取次数增加时,皂苷得率随着次数的增加无显著性差异(p>0.05)。因此提取次数以3次为宜。

图5 提取次数对皂苷得率的影响Fig.5 Effect of extraction times on the yield of saponins

2.2 响应面法优化海地瓜皂苷提取工艺结果

分别以乙醇浓度(A)、提取温度(B)、提取时间(C)和料液比(D)为自变量进行优化,以皂苷的得率(Y)为响应值进行响应面法优化,结果如表2所示。对实验结果进行方差分析,结果如表3所示。方差分析显示,模型p<0.0001,表现极显著(p<0.01),失拟项p=0.3194>0.05表现为不显著(p>0.05),说明该模型拟合效果较好,具有较好的统计学意义。如表4模型的可信度分析,表明该模型能解释88.17%的变异,可应用于海地瓜皂苷提取的模型分析。乙醇浓度(A)、料液比(D)对皂苷得率(Y)表现为极显著(p<0.01),提取温度(B)、提取时间(C)对皂苷得率(Y)具有显著影响(p<0.05)。各因素对皂苷得率(Y)其影响顺序为料液比>乙醇浓度>提取时间>提取温度。

表3 模型方差分析及显著性检验Table 3 Variance analysis and significance test

注:“*”表示在α=0.05水平上显著;“**”表示在α=0.01水平上极其显著。

表2 响应面实验结果Table 2 Results of RSM experiment

表4 模型的可信度分析Table 4 The credibility analysis of the model

从对模型进行二次回归分析,获得皂苷得率二次回归方程:

Y(%)=0.36+0.006108A+0.004433B-0.005317C-0.012D+0.00095AB-0.005775AC-0.015AD+0.003125BC-0.000475BD-0.0012CD-0.0091A2-0.006787B2-0.018C2-0.024D2

乙醇浓度(A)、提取温度(B)、提取时间(C)和料液比(D)交互作用关系如图6～图11所示。结合表3进行分析,可以发现,乙醇浓度(A)和料液比(D)之间存在极显著的交互作用(p<0.01)。而其他因素间的交互作用则表现不显著(p>0.05)。

图6 Y=f(A,B)响应面图Fig.6 Response surface plot of Y=f(A,B)

图7 Y=f(A,C)响应面图Fig.7 Response surface plot of Y=f(A,C)

图8 Y=f(A,D)响应面图Fig.8 Response surface plot of Y=f(A,D)

图9 Y=f(B,C)响应面图Fig.9 Response surface plot of Y=f(B,C)

图10 Y=f(B,D)响应面图Fig.10 Response surface plot of Y=f(B,D)

图11 Y=f(C,D)响应面图Fig.11 Response surface plot of Y=f(C,D)

2.3 验证实验

通过求解二次回归方程偏导数得出海地瓜皂苷的最大值,即获得了海地瓜皂苷的提取最佳工艺,即将乙醇浓度为78.93%,提取温度为73.5 ℃,提取时间2.75 h,料液比为1∶1.729 g/mL,在该条件下,预测在海地瓜皂苷得率为0.37%。根据响应面所确定的醇提法最优工艺参数,对部分参数进行适当调整,在乙醇浓度为79%,提取温度为73.5 ℃,提取时间为2.75 h,料液比为1∶1.7 g/mL的条件下,3次平行实验海地瓜皂苷得率皂苷得率均值为0.378%,RSD=0.15%,与预测值0.37%接近,说明该响应面模型较为可靠,可应用于海地瓜皂苷提取工艺的参数优化。

3 结论与讨论

以海地瓜为原料,应用醇提法对海地瓜皂苷进行提取,对乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间和提取次数开展了单因素分析,并选取乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间为自变量,以皂苷的得率(Y)为响应值,进行响应面法优化,获得最佳的提取工艺为:乙醇浓度为79%,提取温度为73.5 ℃,提取时间为2.75 h,料液比为1∶1.7 g/mL,提取次数3次。4个因变量对响应值影响程度的主次顺序为料液比>乙醇浓度>提取时间>提取温度。结果测定值与模型预测值接近,表明该提取模型与实际提取工艺拟合良好,优化的工艺参数可作为实际的参考依据。

海参皂苷具有广泛的药理活性,是一类具有良好开发前景的海洋生物活性物质[3]。但海参皂苷含量低,成分复杂,相关药理研究较少,极大的限制了海参皂苷的进一步开发利用。目前,海参皂苷的制备主要还是依靠天然提取,因此,开发高效海参皂苷的提取工艺显得尤为重要。此外,对新原料的开发,例如以海地瓜等低值海参为原料,能够有效地降低海参皂苷的制备成本,为规模化海参皂苷的生产制备创造了可能性。本研究采用乙醇进行海参皂苷提取,具有皂苷得率高、操作简便、成本较低等特点,能够为海参皂苷的进一步开发利用打下基础。

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Optimization of extraction process of Saponins fromAcaudinaMolpadioidesby response surface method

SU Yong-chang1,LIU Shu-ji1,RUAN Wei-da2,LIU Qiu-feng1,WANG Yin1,LIU Zhi-yu1

(1.Fisheries Reasearch Instiute of Fujian,National Research and Development Center for Marine Fish Processing(Xiamen),Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province;Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources,Xiamen 361013,China;2.Center for Disease Control and Prevention of Nan’an,Nan’an 362300,China)

Objective:TheoptimumprocessofextractingsaponinsfromAcaudina Molpadioideswithethanolwasstudied.Method:Basedonsinglefactorexperiments,responsesurfacemethodologywereadoptedtoanalyzetheeffectofeachfactorinethanolconcentration,extractiontemperature,extractiontimeandsolid-liquidratioontheextractionofsaponinsfromseacucumber.Theresultsshowedthattheoptimalextractionconditionswereasfollows:concentrationoftheethanol79%,extractiontime2.75h,extractiontemperature73.5 ℃,solid-liquidratio1∶1.7g/mL.Theimpactsoffactorsonyieldofsaponinsfromstrongtoweakweresolid-liquidratio,ethanolconcentration,extractiontimeandextractiontemperature.Anexperimentalsaponinsyieldof0.378%wasobtainedundertheseconditions,whichbasicallyaccordedwiththemodelpredictedvalue.Conclusion:Theobtainedmodelwascredibleandcouldbeusedforactualprediction.

Acaudina Molpadioides;saponins;extraction;Responsesurfacemethodology

2016-06-01

苏永昌(1982- )，男，硕士，助理研究员，从事海洋天然活性物质开发利用研究，E-mail:suyongchang5@126.com。

国家海洋经济创新发展区域示范项目(2014FJPT01)；福建省海洋高新产业发展专项项目[2013]026号；福建省省属公益类科研院所基本科研专项(2016R1003-12)；厦门南方海洋研究中心项目(14PZY017NF17)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)21-0205-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.031