Alcalase对高沟捆蹄肌肉蛋白质水解变化规律研究

张迎阳,强 敏,章建浩

(1.常州大学食品学院,江苏常州 213164;2.镇江市产品质量监督检验中心,江苏镇江 212132;3.南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)



Alcalase对高沟捆蹄肌肉蛋白质水解变化规律研究

张迎阳1,强 敏2,章建浩3,*

(1.常州大学食品学院,江苏常州 213164;2.镇江市产品质量监督检验中心,江苏镇江 212132;3.南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

以猪后蹄肉为原料,在腌制过程添加Alcalase作为酶解剂,并通过响应曲面实验法优化酶解工艺;通过SDS-PAGE电泳分析及游离氨基酸组分分析Alcalase对捆蹄蛋白质的酶解作用规律。结果表明,Alcalase在腌制温度为4～16 ℃时,对促进高沟捆蹄蛋白质水解及提高其感官品质有显著的促进的作用(p<0.05),过量的Alcalase(大于1.6 U/g)会导致蛋白质过度水解,不利于产品的感官品质。响应曲面法优化捆蹄加工工艺结果为:Alcalase添加量1.32 U/g、腌制温度14.2 ℃、腌制时间21.3 d,产品蛋白质水解指数为14.81%,感官评分92.47。另外,添加Alcalase蛋白酶后,捆蹄中高分子蛋白(≥120 ku)有明显的分解作用,并且在30～40 ku及50～70 ku处,蛋白质条带逐渐累积;Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Ile、Gly、His有显著的增加,而Pro、Glu含量显著降低(p<0.05)。因此,Alcalase能显著促进捆蹄中蛋白质的分解,提高产品的感官品质,可以应用于捆蹄产业的生产加工。

捆蹄,Alcalase酶解,工艺优化,蛋白质水解

高沟捆蹄是江苏省淮安市著名特产,历史悠久且加工过程精细,在全国范围内享誉盛名[1-2];其加工原料为猪蹄髈肉及其他调味料,具有原料廉价、食用方便的特点,深受消费者的喜欢[3-4]。但是随着消费者生活水平的提高,在丰富产品风味品质及营养成分的同时,消费市场对捆蹄的食用品质也提出了更高的要求[5]。主要是因为捆蹄中含有较多的肌纤维蛋白质及胶原蛋白质,影响了产品的嫩度,影响了现代消费者对产品的食用品质[6]。因此,提高捆蹄的食用品质,以适应现代消费理念,对促进高沟捆蹄的发展具有重要的推动作用。研究表明,在捆蹄腌制过程中添加的天然香辛料等对肉制品的嫩度改善作用较小[7-8];因此,本研究以酶解作用专一性较弱的Alcalase作为外源蛋白酶,利用其酶解作用专一性较弱的特点改善捆蹄的食用品质。研究报道,Alcalase酶切作用位点主要为Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Trp[9-10],并且酶解条件温和、产物安全性高、营养价值高、易消化、易与其他风味物质搭配,是改造蛋白质,提高蛋白质价值的最有效途径之一,在风鸡及肉的副产品加工领域中已有广泛的应用[11-13],但是在捆蹄等猪肉产品中的研究中还未见报道。本研究通过在腌制过程中添加Alcalase作为酶解腌制剂,通过响应曲面实验法优化捆蹄酶解加工工艺,并且通过捆蹄产品的蛋白质分解及游离氨基酸释放规律验证该工艺的可行性,以期为捆蹄产业的开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪后蹄肉 同批猪肉,猪龄11个月,购自淮安苏食肉品有限公司;食盐、香辛料及调味料均为高沟市售;碱性蛋白酶(Alcalase)2.4L(酶活力>200×104U/g) 丹麦诺维信公司;考马斯亮蓝、过硫酸胺、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)、溴酚蓝、巯基乙醇均为Sigma试剂公司;消化片(5.5 g硫酸钾和0.5 g无水硫酸铜)、三氯乙酸(TCA)、硫酸(H2SO4)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、水杨酸、盐酸等常规化学试剂均为国药集团分析纯级。

HH-W420数显三用恒温水箱 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;TM自动凯氏定氮仪 丹麦Foss分析仪器公司;FR-980生物电泳图象分析系统 上海复日科技有限公司;Beckman Allegra 64R冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司;2300型Kjeltec 101-O-S电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械厂;602S稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂;JA2203N电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;氨基酸自动分析仪 日本日立公司;SPX-250C型恒温恒湿箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 捆蹄加工工艺 原料肉→清洗切碎→修整→腌制→捆扎→蒸煮→冷却包装

工艺加工点:腌制,将配制好的香辛料及调味料等与碎肉混匀,在所需的温度条件下腌制;捆扎,将腌制好的原料肉用肠衣包裹,用长约蒸煮消毒过的麦草绳将包裹好的捆蹄先扎紧(间距约2 cm),成圆形蹄髈形状(直径约4 cm)。

1.2.2 单因素实验 腌制温度:在捆蹄腌制阶段固定Alcalase添加量为1.2 U/g(酶溶液为10 U/g的磷酸缓冲液),分别在腌制温度为0、4、8、12、16、20 ℃条件下,腌制20 h,分析产品蛋白质的分解情况及感官评价结果。对照组:未添加Alcalase。

Alcalase添加量:在捆蹄腌制阶段固定Alcalase添加量为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 U/g(酶溶液为10 U/g的磷酸缓冲液),在12 ℃条件下腌制20 h,分析产品蛋白质的分解情况及感官评价结果。

腌制时间:在捆蹄腌制阶段固定Alcalase添加量为1.2 U/g(酶溶液为10 U/g的磷酸缓冲液),在腌制温度为12 ℃条件下分别腌制16、18、20、22、24、26 h,分析产品蛋白质的分解情况及感官评价结果。对照组:未添加Alcalase。

1.2.3 响应面法实验设计 在Alcalase酶解捆蹄肌肉蛋白质的单因素实验结果基础上,以Alcalase添加量、腌制温度及腌制时间为因素(以X1、X2、X3表示),具体取值范围见表1;以产品的蛋白质水解指数及感官评分值为响应值采用design-expert8.0.6设计响应曲面实验。

表1 因素水平表Table 1 Levels and factors of test

1.2.4 蛋白质水解指数测定 蛋白质水解指数测定按照如下方法[14]:

总氮(TN)测定:将解冻的样品剔除可见脂肪、肌内膜和肌间膜并绞碎,称取1.000 g上述样品以及1块消化片和12 mL浓硫酸于消化管中,消化1.5 h(420 ℃),用凯氏定氮仪测定样品中氮的含量。

非蛋白氮(NPN)含量测定:将解冻的样品剔除可见脂肪、肌内膜和肌间膜并绞碎,称取5.000 g上述样品于离心管中,并加入25 mL的10% TCA(m/V)溶液混匀,10000 r/min下分三次高速匀浆20 s,4 ℃下放置过夜后5000 g冷冻离心5 min,过滤取滤液于消化管中,用5 mL硫酸于220 ℃下烘干水分,再将7 mL硫酸加入消化管中于420 ℃下消化1.5 h,用凯氏定氮仪测定样品中氮的含量。

蛋白质水解指数(P.I.%)=NPN/TN%

1.2.5 游离氨基酸组成测定 参照Virgil的方法测定[15]:准确称取样品6.00 g,加入60 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5),匀浆(6000 r/min,3 min),离心(10000×g,4 ℃,20 min),定容至100 mL,取上清液5 mL,用3%水杨酸溶液调节pH至2.0,离心(15000×g,4 ℃,20 min),用双蒸水定容至10 mL,取溶液0.5 mL,使用0.02 mol/L盐酸稀释5倍,用氨基酸自动分析仪检测。检测条件:洗脱液为柠檬酸缓冲液(pH3.3～4.9),显色液为茚三酮∶乙二醇甲醚∶乙酸钠缓冲液=2.75∶25∶1,除羟脯氨酸在440 nm检测外,其余氨基酸均在570 nm检测。

表2 感官评价指标及标准Table 2 Evaluation and standards of sensory evaluation

1.2.6 SDS-PAGE电泳分析 SDS-PAGE实验方法[16-17]:将酶解后的蛋白产物配制成蛋白样品并与标准分子量蛋白进行SDS-PAGE,分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%,用考马斯亮蓝G-250染色,Quantity-One分析蛋白质分子量。

1.2.7 感官评定方法 分别请具有捆蹄生产经验的技术人员10人参加产品的感官评定,产品的感官评价方法采用赵接红[1]对淮阳捆蹄的感官评定方法,分别从颜色、气味、滋味、质地四个方面分析。具体指标见表2(n=3)。

1.2.8 数据统计分析 用Microsoft Excel进行数据整理及作图分析。不同平均值之间用SAS 9.2(SAS Institute Inc,Cary,North Carolina,USA)统计软件的GLM程序(General Linear Model procedure)中的邓肯氏多重比较法(Duncan’s Multiple Range Test)进行差异显著性检验(n=3)。

2 结果与分析

2.1 Alcalase酶解捆蹄肌肉蛋白质过程的单因素分析

肉制品中蛋白质水解指数是非蛋白氮与蛋白氮的比值,是衡量肉制品品质的重要指标;研究表明,在肌肉中蛋白质水解指数超过15.0%时会明显增加其嫩度,但可能会出现变粘、不成形等不良现象[2,18],因此调控捆蹄中蛋白质的水解程度也是提高产品品质的重要因素。图1为腌制温度对捆蹄品质的影响。随着腌制温度的升高,捆蹄的蛋白质水解指数呈显著的升高趋势(p<0.05),并且在腌制温度大于8 ℃后,实验组蛋白质水解指数显著高于对照组(p<0.05);因此可以看出,Alcalase对捆蹄蛋白质水解有促进作用;当腌制温度为20 ℃时,该指标为16.35%±0.18%。对应产品的感官品质可以看出,伴随着蛋白质水解程度的增加,在一定腌制温度范围内(4～16 ℃),实验组感官评分显著高于对照组。因此,在一定腌制温度范围内(4～16 ℃),Alcalase可显著提高捆蹄产品的感官品质(p<0.05)。

图1 不同腌制温度对捆蹄蛋白质 水解指数及感官品质的影响Fig.1 Effect of temperature on PI and sensory evaluation of bundle hoof

由图2可以看出,随着Alcalase添加量的增加,捆蹄蛋白质水解指数呈显著的增加趋势(p<0.05),并且在添加量大于1.2 U/g后,蛋白质水解指数急剧增加,对应的产品的感官品质随着Alcalase添加量的增加呈显著的增加(p<0.05)。但是,当酶添加量大于1.6 U/g后,感官品质显著降低(p<0.05)。主要是因为过量的Alcalase导致捆蹄蛋白质过度水解,从而降低了产品的感官品质[14]。

图2 Alcalase添加量对捆蹄蛋白质 水解指数及感官品质的影响Fig.2 Effect of Alcalase dosage on PI and sensory evaluation of bundle hoof

表3 响应曲面实验结果Table 3 Results of response surface

注:同列中不同字母(a.b.c…)表示差异显著(p<0.05)。由图3可以看出,随着腌制时间的延长,捆蹄的蛋白质水解指数呈显著的增加趋势,并且实验组显著高于对照组(p<0.05);在腌制26 d时,实验组蛋白质水解指数为15.56%±0.19%;而对于产品的感官品质,对照组在腌制过程中呈显著的增加趋势;但是对于实验组,在腌制22 d后出现显著的下降趋势(p<0.05),可能是因为随着腌制时间的延长,Alcalase导致蛋白质过度水解,从而影响了产品的风味品质[14]。

图3 不同腌制时间对捆蹄蛋白质 水解指数及感官品质的影响Fig.3 Effect of time on PI and sensory evaluation of bundle hoof

综合上述分析可以看出,在捆蹄的腌制过程中,外源蛋白酶Alcalase能显著的促进捆蹄蛋白质水解的进程,并且与腌制条件呈显著的相关性。进一步优化腌制工艺对捆蹄生产加工有重要的意义。

2.2 高沟捆蹄腌制工艺优化

2.2.1 响应曲面实验结果 从响应曲面实验结果可以看出,部分处理组能显著提高蛋白质水解指数,并且对捆蹄的感官评分有显著的促进作用。

2.2.2 响应面实验结果分析

2.2.2.1 回归模型建立及显著性分析 对表3中的数据分别以PI(Y1)及感官评分(Y2)为响应值,以Alcalase添加量(X1)、腌制温度(X2)、腌制时间(X3)为自变量建立二次回归模型如式(1)、式(2)。为了进一步分析回归模型的显著性及变量因素对响应值的影响程度,对模型系数进行检验结果见表4。

Y1=15.040+1.883X1-0.432X2-0.711X3+0.180X1X2+0.213X1X3+0.083X2X3-2.624X12-0.044X22-5.766×10-3X32

式(1)

Y2=-93.511+40.946X1+3.935X2+12.310X3+0.143X1X2-0.057X1X3+0.027X2X3-15.840X12-0.166X22-0.296X32

式(2)

表4 回归模型系数显著性检验Table 4 Test for significance of regression coefficients

注:p<0.01水平极显著,用**表示,p<0.05水平显著,用*号表示。

表5 不同处理捆蹄中游离氨基酸含量分析Table 5 Analysis of hydrophobic amino acids in bundle hoof

注:同行中不同字母(a.b)表示差异显著(p<0.05)。2.2.2.2 模型的交互作用分析 腌制温度与腌制时间对PI的交互作用分析:在固定Alcalase添加量为1.2 U/g时,腌制温度及腌制时间对捆蹄蛋白质水解指数影响的交互作用结果见图4。从图中可以看出,在腌制温度为12～18 ℃时,腌制时间存在临界值约为20～22 ℃;并且从图中可以看出,随着腌制温度的升高,影响捆蹄蛋白质水解指数的腌制时间的临界值呈显著的降低趋势。

图4 腌制温度和腌制时间 对蛋白质水解指数的交互作用影响Fig.4 Interactive effect between temperature and time on PI

2.2.2.3 工艺优化 综合上述分析,利用design-expert8.0.6自带的回归分析程序对实验中建立的回归模型进行优化分析,在固定蛋白质水解指数为13%～15%时,以感官评分的最大值为优化目标,得到捆蹄腌制优化工艺为:Alcalase添加量1.32 U/g、腌制温度14.2 ℃、腌制时间21.3 d,得到PI为14.81,感官评分92.47。以该工艺腌制捆蹄进行验证实验得到,PI为14.73%±0.21%,感官评分为93.11±0.86,相对误差小于5%。因此该工艺可以用于捆蹄的生产加工。

2.3 捆蹄肌肉蛋白质Alcalase酶解规律分析

2.3.1 SDS-PAGE电泳分析 研究表明,Alcalase对蛋白质的酶解作用主要集中于大于72 ku的分子条带,并且小于30 ku的分子条带逐渐累积[19]。通过SDS-PAGE电泳分析后可以看出,相比于对照组,实验组中高分子蛋白(≥120 ku)有明显的分解作用,表现为该处蛋白条带逐渐变暗;另外,在30～40 ku及50～70 ku处,也存在蛋白质逐渐变暗。因此进一步证明,Alcalase对促进捆蹄蛋白质分解有明显的促进作用。

图5 捆蹄蛋白质SDS-PAGE电泳结果Fig.5 Result of SDS-PAGE electrophoresis of bundle hoof proteins注:a为实验组;b为对照组。

2.3.2 游离氨基酸释放规律研究 Alcalase是一种专一性较弱的蛋白酶,能够对蛋白质深度酶解,并且在肌肉蛋白质酶解中,Alcalase作用位点主要集中于Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Trp,可显著增加肌肉中游离氨基酸含量[10,20]。从表5可以看出,实验组捆蹄中游离氨基酸总量显著高于对照组(p<0.05),并且Ala、Leu、Val、Tyr、Phe均有显著的增加(p<0.05),进一步证明了Alcalase嫩化捆蹄肌肉成分的作用。但是对捆蹄中游离氨基酸的结果可以看出,与对照组相比,除了Ala、Leu、Val、Tyr、Phe外,Ile、Gly、His也有显著的增加。另外,在实验组中,Pro、Glu含量显著低于对照组(p<0.05),可能是因为在腌制过程中转变为其他风味成分。

3 结论

Alcalase在腌制温度为4～16 ℃时,对促进高沟捆蹄蛋白质水解及提高其感官品质有显著的促进的作用(p<0.05),并且过量的Alcalase(大于1.6 U/g)会导致蛋白质过度水解,从而降低了产品的感官品质;腌制温度及腌制时间对捆蹄蛋白质水解指数有显著的交互作用,表现为随着腌制温度的升高,影响捆蹄蛋白质水解指数的腌制时间的临界值呈显著的降低趋势。响应曲面法优化捆蹄加工工艺为:Alcalase添加量1.32 U/g、腌制温度14.2 ℃、腌制时间21.3 d,得到PI为14.81%,感官评分92.47。SDS-PAGE电泳分析后可以看出,实验组中高分子蛋白(≥120 ku)有明显的分解作用,并且在30～40 ku及50～70 ku处,也存在蛋白质条带逐渐变暗。腌制结束后,Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Ile、Gly、His有显著的增加,而Pro、Glu含量显著降低(p<0.05)。

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Study on muscle protein hydrolysis by Alcalase and optimization pickled process of Gaogou bundle hoof

ZHAGN Ying-yang1,QIANG Min2,ZHANG Jian-hao3,*

(1.College of Food Science,Changzhou University,Changzhou 213164,China;2.Zhenjiang product quality supervision and inspection center,Zhenjiang 212132,China;3.College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Inthisstudy,hindhoofmeatwasusedtoproducebundlehoofwithAlcalaseascuringagentandtheprocesswasoptimizedbyresponsesurfacemethod.EnzymatichydrolysisofAlcalaseonbundlehoofproteinwasanalyzedbythemethodofSDS-PAGEelectrophoresisandfreeaminoacidsreleased.TheresultshowedthatAlcalasecouldpromoteproteolysisandimprovethesensoryqualityofbundlehoofwithpickledtemperatureat4～16 ℃.BundlehoofproteincouldbeexcessivehydrolysisandhadbadsensoryqualitywiththeAlcalasedosagehigherthan1.6U/g.TheresultofbundlehoofprocessingoptimizedbytestofresponsesurfacewasAlcalasedosagewas1.32U/gandpickledtemperaturewas14.2 ℃andpickledtimewas21.3d,thenPIwas14.81%andsensoryevaluationwas92.47.SDS-PAGEelectrophoresisshowedproteinhandswithhigherthan120,30～40kuand50～70kuweredecompositionsignificantly,thenAla,Leu,Val,Tyr,Phe,Ile,Gly,HiswassignificantincreasedandPro,Glu(p<0.05)wasdecreasedsignificantly.ItwascouldbeconcludethatAlcalasecouldsignificantlypromotethedecompositionofbundlehoofproteinandimprovethesensoryqualityoftheproduct.SotheAlcalasecouldbeappliedtobundlehoofproduction.

bundlehoof;Alcalase;processoptimization;proteolysis

2016-06-06

张迎阳(1980-)，男，博士研究生，研究方向：畜产品加工与质量控制，E-mail:callfull@163.com。

*通讯作者:章建浩(1961-)，男，博士，教授，研究方向：畜产品加工与质量控制，E-mail:nau_zjh@njau.edu.cn。

淮安市科技计划项目(HAN2014030)；国家公益性行业(农业)科研专项(201303082-2)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)21-0249-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.039