响应面法优化超高压钝化蓝莓汁中两种酶活性工艺条件

李星贺,朱金艳,2,孟宪军,*

(1.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110161;2.庄河市食品检验监测中心,辽宁大连 116400)



响应面法优化超高压钝化蓝莓汁中两种酶活性工艺条件

李星贺1,朱金艳1,2,孟宪军1,*

(1.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110161;2.庄河市食品检验监测中心,辽宁大连 116400)

为了得到超高压钝化蓝莓汁中酶活性的最优工艺参数,选取过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的酶残留活性为响应值,根据Central-Composite实验设计原理,建立了酶的残留活性与超高压处理压力、时间和温度之间的数学模型。并采用Design-Expert8.0.6进行响应面分析。实验结果表明:钝化过氧化物酶(POD)最佳处理条件为:处理压力500 MPa、时间5 min和温度40 ℃,处理后POD酶的残留活性降至49.13%;钝化多酚氧化酶(PPO)最佳处理条件为:处理压力500 MPa、时间15 min和温度10 ℃,处理后PPO酶的残留活性降至4.776%。此外,在实验条件为压力500 MPa、处理时间15 min及温度10 ℃时处理蓝莓汁,POD和PPO的综合钝化效果最佳。

过氧化物酶,多酚氧化酶,超高压,响应面法,蓝莓汁

蓝莓(Blueberry)属杜鹃花科越桔属植物,果实呈蓝色,果肉细腻,果味酸甜,风味独特。蓝莓含有丰富的营养成分及多种酶类,如花色苷、维生素A、B、E、矿物质及过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)等[1-3]。蓝莓果实由于存在收获时间短、季节性强、不耐贮存运输等缺点,所以给鲜销带来很大困难,目前主要采用榨汁并经杀菌的方式予以解决,但杀菌过程往往会造成产品的色泽、风味、营养等品质指标下降,严重影响产品的可接受程度[4]。因此以响应面法优化超高压钝化蓝莓汁中两种酶活性工艺条件,达到兼顾杀菌与保留品质的双重目标。

超高压加工工艺是一种新兴的冷加工技术,近些年来发展十分迅速[5-8]。在多种水果加工研究中发现,超高压处理不仅能杀灭水果果肉或果汁中的微生物,延长产品保藏期,并且可以抑制酶的活性[9-11]。POD、PPO均为降解花色苷的酶,能水解花色苷糖苷键产生花色素和糖,对蓝莓汁中花色苷含量产生影响。并且会使蓝莓汁褐变,影响产品的外观,同时催化反应产物会影响果汁的口感和风味[12-15]。超高压钝化酶是通过改变酶蛋白的构象,即变性来抑制酶的活性[16-17]。酶的催化作用产生于其活性中心,活性中心与三维构象有关。高压对酶的影响分为两种情况:压力较低时可能激活酶,压力较高时使酶失去活性,加热可以强化高压抑制酶活性,超高压处理中,酶的活性不仅取决于压力的大小,同时与处理温度、保压时间和处理对象的化学组成都有关系[18]。目前国内外对蓝莓汁超高压灭菌效果研究较多,但对蓝莓汁超高压过程中POD、PPO的变化研究较少。

经研究发现加工工艺对蓝莓汁中花色苷含量产生影响,而POD、PPO为降解花色苷的酶。因此,采用响应面法对超高压钝化蓝莓汁中两种酶活性的工艺条件进行优化,得到两种酶钝化效果最佳的工艺条件,进而降低蓝莓汁中花色苷的降解,减少加工工艺对花色苷含量造成的损失。使蓝莓果汁在达到卫生标准的前提下,保持产品原有风味口感和营养成分。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓 品种为 “蓝丰”,采自辽宁省庄河蓝莓基地,采摘后实验室-18 ℃冷藏;乙酸、乙酸钠、PEG、PVPP、TritonX-100、愈创木酚、过氧化氢、邻苯二酚均购于国药试剂。

全自动超高压杀菌机(HPP-600-L) 温州滨一机械有限公司;循环水真空泵(SHZ-DIII) 巩义市予华仪器有限责任公司;高速离心机(CR21G) 日本日立公司;恒温水浴锅(PK-S26) 上海精宏实验设备有限公司;分光光度计(Varian Cary WinUV) 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 试样的准备 试样制作工艺流程:蓝莓→烫漂解冻→1∶5(质量比)加水榨汁→过滤去渣(两层粗纱布)→4 ℃,12000 r/min下离心10 min→取上层液抽滤→定量、装瓶(聚乙烯塑料瓶,不留顶隙)

1.2.2 实验方案 以前期实验为基础得到结论,随着超高压压力的升高、保压时间的延长及介质温度的升高,POD和PPO的残留活性降低。采用Design-Expert8.0.6进行响应面设计,以压力、时间和温度作为自变量,以POD和PPO的残留活性为响应值,局限于实验室现有实验条件,实验因素水平及编码见表1。空白对照为常压(0.1 MPa)下未经处理的样品[19-21]。

表1 实验因素水平编码表Table 1 Experimental values and coded level of factors

1.3 酶的活性检测

1.3.1 过氧化物酶(POD)酶活性的测定 反应混合液为0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)50 mL、50 mmol/L愈创木酚溶液19 μL及30% H2O2溶液228 μL,取光径为1 cm比色皿两个,一个加入1 mL酶液和3 mL反应混合液,另一个加入3 mL 0.2 mL/L磷酸缓冲液(pH6.5)作为对照。用分光光度计在470 nm处测定反应3 min前后反应液吸光度变化[18]。

1.3.2 多酚氧化酶(PPO)酶活性的测定 取0.2%的邻苯二酚溶液(用0.2 mol/L、pH7.4磷酸缓冲液配制)5 mL于试管中,25 ℃下水浴10 min,加入酶液0.5 mL,混匀后,放置1 min后在415 nm处测定吸光度,空白用5 mL磷酸缓冲液代替邻苯二酚溶液[22-23]。

1.3.3 酶活性的定义 以每分钟每毫升酶液吸光度变化0.01定义为1个酶活性单位。

1.3.4 酶的残留活性的定义 酶的残留活性(%)=处理后酶活性/对照样品酶的活性×100

2 结果与讨论

2.1 响应面法优化超高压钝化酶结果

实验实施方案及结果如表2所示。

2.2 POD回归方程模型建立及显著性检验

利用Design-Expert8.0.6软件对实验结果进行分析,得到POD残留活性(Y1)与超高压处理压力(X1)、超高压处理时间(X2)、传热介质温度(X3)因素在编码空间的二次多元回归方程为:Y1(%)=-74.7229+1.145672X1-0.92984X2-0.27557X3+0.0128X1X2+0.004569X1X3+0.069787X2X3-0.00184X12-0.2913X22-0.0651X32

表3 POD回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)of regression model of POD

注:“**”表示极显著(p<0.0001),“*”表示显著(0.0001

表2 实验设计与结果Table 2 Experimental results for response surface analysis

由F值可见,F3>F1>F2,3个因素对酶的残留活性影响主次顺序为温度>压力>时间。F13>F12>F23,压力和温度的交互作用最大,对酶的活性影响最明显。

图1 各因素交互作用对POD酶活性 残留率影响的响应面图Fig.1 Response surface graphs showing the interactive effect of POD activation

从图1a～图1c可以看出各参数之间的相互作用及对POD残留活性的影响。如图所示,若曲线越陡峭,则表明该因素对POD残留活性的影响越大,相应表现为响应值变化的大小。从图可以看出超高压温度对POD残留活性的影响最大,压力次之,时间的影响最小。表3回归分析结果也与此相吻合。当温度和压力一定时,随着时间的增加,POD残留活性呈现下降的趋势;当超高压处理时间和压力一定时,在温度为大于22 ℃时,POD的酶残留活性呈大幅度下降趋势。在温度与时间不变时,在压力为300～400 MPa范围内,POD酶出现被激活现象。低压下酶的构象没有太大变化或失去活力;压力促进酶从附着状态中解离出来,提高了酶的活性;此外蓝莓汁中尚存匀浆机未破碎细胞,在压力作用下细胞膜被损坏或改变了膜的通透性,使细胞内部的过氧化物酶泄露出来,也会导致酶活性升高[23-24]。

表4 PPO回归方程方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)of regression model of PPO

注:“**”表示极显著(p<0.0001),“*”表示显著(0.0001

2.3 PPO回归方程模型建立及显著性检验

利用Design-Expert8.0.6软件对实验结果进行分析,得到PPO残留活性(Y1)与超高压处理压力(X1)、超高压处理时间(X2)、传热介质温度(X3)因素在编码空间的二次多元回归方程为:Y2(%)=19.3957+0.31162X1-6.01009X2+1.112519X3-0.00531X1X2-0.00075X1X3+0.211097X2X3-0.00031X12+0.012546X22-0.05449X32

根据回归方程绘图(图2a～图2b),它们直观描述了X1、X2、X3及三个因素之间交互作用对PPO残留活性的影响。由图:压力对PPO残留活性的影响不明显,随着温度的增加,PPO残留活性出现一定幅度地减少,升温会弱化酶蛋白的一些氢键、疏水键、离子键和静电相互作用高压增强这种弱化作用的效果,使酶的三维构象受到破坏,加速多酚氧化酶的失活[15,22]。但相较温度,时间对PPO残留活性的影响较大。尤其是10～15 min范围内,PPO残留活性出现急剧下降。由表4中可见,X1X3的F=1.63,故不考虑压力和时间的交互作用对PPO残留活性的影响。

图2 各因素交互作用对PPO酶活性残留率影响的响应面图Fig.2 Response surface graphs showing the interactive effect of PPO activation

2.4 超高压钝化POD和PPO的工艺优化与验证

采用Design-expert 8.0.6进行优化设计,目标值为POD、PPO酶残留活性及两种酶残留活性之和最低,结果如表5所示,每组设平行实验三组。

表5 优化实验及结果Table 5 Optimization experiment and result

验证实验测得,考虑仪器设备及实际操作情况,在将最优处理条件设置为压力500 MPa、时间5 min和温度40 ℃时,POD的酶残留活性降至49.13%,与预测值相差0.2%;在处理条件为压力500 MPa、时间15 min和温度10 ℃时,PPO的酶残留活性降至4.776%,与预测值相差0.08%;综合考虑，在处理条件为压力500 MPa、处理时间15 min及温度10 ℃处理蓝莓汁时,钝化酶效果最佳，此时，POD残留活性79.459%，PPO残留活性7.239%。因此采用超高压处理,优化结果准确可靠,符合生产实践实际。

3 结论

采用超高压处理技术钝化蓝莓汁中过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO),以超高压处理的压力、时间和温度为自变量,以两种酶的残留活性为响应值,通过回归分析,建立的回归方程模型极显著,失拟性不显著。R2分别为0.9957和0.9917皆小于1。说明回归方程与实验结果拟合性很好。

根据方差分析结果和响应面图可知,在超高压处理压力为300～500 MPa、时间为5～15 min及温度在10～40 ℃的条件下,对POD的酶残留活性影响主次顺序为温度>压力>时间。对PPO的酶残留活性影响主次顺序为时间>温度>压力。

利用Design-Expert8.0.6软件优化回归方程确定钝化过氧化物酶(POD)最佳处理条件为:处理压力500 MPa、时间5 min和温度40 ℃,处理后酶的残留活性降至49.13%;钝化多酚氧化酶(PPO)最佳处理条件为:处理压力500 MPa、时间15 min和温度10 ℃,处理后酶的残留活性降至4.776%;钝化两种酶残留活性的最佳处理条件为:处理压力500 MPa、时间15 min和温度10 ℃。

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Optimization of ultra-high pressure conditions for inactivation of two enzymes in blueberry juice by response surface methodology

LI Xing-he1,ZHU Jin-yan1,2,MENG Xian-jun1,*

(1.Food College of Shen Yang Agriculture University,Shenyang 110161,China;2.Food Inspection Monitoring Center of Zhuanghe,Dalian 116400,China)

Inordertogettheoptimumprocessparametersthatinactivatetheenzymesactivitiesinblueberryjuiceduringultra-highpressuretreatment,activitiesofperoxidase(POD)andpolyphenoloxidase(PPO)weretakenastheresponsevalues.AccordingtotheprincipleofCentral-Compositeexperimentdesign,themathematicalmodelofenzymeresidualactivitiesandpressure,timeandtemperaturewereestablished.Design-Expert8.0.6wasusedforresponsesurfaceanalysis.TheresultsshowedthattheoptimumconditionsforinactivatingPODwere:pressure500MPa,time5minandtemperature40 ℃,afterprocessingusingtheseconditions,theresidualactivitiesofPODwas49.13%,theoptimumconditionsforinactivatingPPOwere:pressure500MPa,time15minandtemperature10 ℃,undertheseconditions,theresidualactivitiesofPPOwas4.776%.Additionally,blueberryjuicewastreatedundertheconditionsofpressure500MPa,time15min,andtemperature10 ℃,thepassivationeffectofPODandPPOwasoptimum.

peroxidase;polyphenoloxidase;ultra-highpressure;responsesurfacemethod;blueberryjuice

2016-05-12

李星贺(1992-)，女，硕士，研究生，研究方向：小浆果深加工关键技术，E-mail：syaulxh@163.com。

*通讯作者:孟宪军(1960-)，男，博士，教授，研究方向：小浆果深加工关键技术，E-mail：mengxjsy@126.com。

农业部公益性行业(农业)科研专项(201303073)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)21-0269-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.043