HPLC法测定姜黄根茎及姜黄素饮料中姜黄素类化合物的含量

孙鹏尧,李丹丹,牟德华

(河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050018)



HPLC法测定姜黄根茎及姜黄素饮料中姜黄素类化合物的含量

孙鹏尧,李丹丹,牟德华*

(河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050018)

建立高效液相色谱(HPLC)测定姜黄根茎以及姜黄素饮料中姜黄素类化合物的含量。样品用乙醇辅助超声波提取,以DIKMA Platisil ODS(4.6 mm×250 mm,5 μm)柱为分析柱,乙腈和水(磷酸调pH为3.0)为流动相进行梯度洗脱,流速:1.0 mL/min,检测波长:425 nm,柱温:30 ℃。姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素分别在1.00～200.00,0.96～192.00,0.96～192.00 mg/L范围内线性关系良好,相关系数R2>0.999。平均回收率分别为106.87%(RSD=1.24%)、105.28%(RSD=0.48%)、96.86%(RSD=0.26%)。本方法操作简单、快速、重复性好,可用于姜黄根茎及饮料中的姜黄素类化合物的检测。

HPLC,姜黄,饮料,姜黄素类化合物,含量测定

姜黄,为姜科姜黄属植物(CurcumalongaL.)的根茎,是多年生草本植物,主要分布在中国、印度、缅甸及其他热带、亚热带地区。姜黄素类化合物为它的主要生物活性成分,具有抗炎抑菌[1-2]、抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抗癌[4-5]、抗病毒[5]、抗动脉粥样硬化[6]、保肝护肝[7]等多种药理功效。姜黄素类化合物多用于医药、食品着色剂以及化妆品上[8],它作为药物中的有效成分和重要的天然色素染料几乎没有任何副作用[9],应用日益广泛,并逐渐被应用到保健食品和饮料上。目前对于保健食品和饮料中的姜黄素的测定还没有相应的国标方法。因此,建立简便可行的HPLC检测方法极为重要。

姜黄素类化合物的检测方法主要有分光光度计法、薄层色谱法、毛细管电泳法、HPLC法等[10-13]。其中,分光光度计法适用于姜黄素的初级定量,测定的是总姜黄素类化合物的含量[14];薄层色谱法通常用来做半定量或限定实验,由于姜黄素类化合物不稳定,在薄层上分离时容易受光及其他因素影响,导致目标检测物测定结果不够精确[14];毛细管电泳法相对于其他分析方法来说重现性较差;HPLC法因其分离效果好、选择性好、灵敏度高等特点成为目前测定姜黄素类化合物的常用方法[15-18]。本文建立了一种测定姜黄根茎和姜黄素饮料中的姜黄素类化合物的方法,并进行了方法学的研究。该方法简便、快捷、重现性好,可用于测定姜黄及其同属植物以及饮料中姜黄素类化合物的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干燥姜黄根茎 河北食品添加剂有限公司提供,分别购自缅甸、印度、四川犍为县;市售姜黄饮料 日本市场(品牌);自制姜黄饮料;复合稳定剂(黄原胶∶CMC∶果胶∶β-环糊精=3∶3∶1∶2),本实验室调配。

姜黄素对照品(Ⅰ)、去甲氧基姜黄素对照品(Ⅱ)、双去甲氧基姜黄素对照品(Ⅲ)成都艾科达试剂有限公司,纯度均≥98%;乙醇 石家庄新宇三阳实业有限公司,分析纯;乙腈 湖北杜文化工科技有限公司公司,色谱纯;实验用水为高纯水,其他试剂均为分析纯。

LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司;Platisil ODS柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 北京迪马欧泰科技发展中心;756P型紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司;DELTA 320型pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司;ARI 140型电子分析天平 美国双杰兄弟集团有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 姜黄素饮料的制备加工工艺 参照文献[19]的工艺,在高速搅拌下将复合稳定剂加到60～70 ℃水中,完全溶解后加入姜黄素及其他辅料(柠檬酸、阿斯巴甜、果葡糖浆),然后经过均质、灌装、杀菌、冷却,得到成品。其中,姜黄素原料加入量为0.30%,复合稳定剂加入量为0.3%,柠檬酸加入量为0.18%,阿斯巴甜加入量为0.02%,果葡糖浆加入量为4.00%[19]。

1.2.2 对照品溶液的配制 准确称取姜黄素对照品Ⅰ 0.0250、Ⅱ 0.0240、Ⅲ 0.0240 g分别置于25 mL的容量瓶中,用甲醇溶解稀释至刻度,摇匀,配制成浓度为1 mg/mL的对照品储备液。分别吸取上述对照品储备溶液各5 mL,加甲醇定容至25 mL,作为姜黄素类化合物对照品溶液。

1.2.3 样品处理 姜黄根茎:将干燥的姜黄根茎用粉碎机粉碎,过40目筛得姜黄粉末,放真空干燥器中备用。称取1.0 g姜黄粉末于150 mL锥形瓶中,加入20 mL 90%乙醇超声提取(功率为100 W,40 ℃)30 min,4500 r/min离心15 min,提取3次,合并上清液于100 mL容量瓶中,用90%乙醇定容至刻度[20]。

姜黄素饮料:取5 mL样品于50 mL离心管中,加入25 mL 90%乙醇超声波提取(功率为100 W,室温)15 min,4500 r/min离心15 min,取上清液于50 mL容量瓶中,用90%乙醇定容至刻度[21]。

所有样品过0.45 μm的滤膜,待分析。

1.2.4 HPLC检测姜黄素类化合物的色谱条件

1.2.4.1 检测波长的确定 用紫外-可见分光光度计对姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素标品溶液进行全波长扫描,根据姜黄素类化合物在紫外波长范围内的最大吸收峰确定实验用紫外吸收的波长。

1.2.4.2 流动相、流速及其pH的确定 HPLC检测姜黄素类化合物含量,选用C18柱时,流动相一般为乙腈和水。本实验在相同色谱条件下,分别用冰乙酸、甲酸、磷酸、三氟乙酸调节水溶液的pH(pH=3.0)。比较不同酸性试剂调节水相pH时对姜黄素类化合物分离效果的影响,根据分离效果确定流动相。流动相的pH、流速根据单因素实验设计进行优选,流动相pH为2.5、2.8、3.0、3.5、4.0,流速为0.3、0.5、0.8、1.0 mL/min。

1.2.4.3 柱温的确定 本研究采用迪马Platisil ODS C18色谱分离柱,柱温分别选择25、30、35 ℃下进行检测,优化各参数。

1.2.5 姜黄素类化合物标准曲线的建立和方法学的考察

1.2.5.1 姜黄素类化合物标准曲线的建立 精密吸取姜黄素类化合物对照品溶液,将其配制成1、2、20、40、100、200 mg/L的对照品溶液,在最优的色谱条件下检测。以不同浓度的姜黄素类化合物为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线并得出线性回归方程。检出限以3倍的信噪比(S/N)计算得出[18]。

1.2.5.2 方法学考察实验 精密度实验:精密吸取姜黄素类化合物对照品溶液,取20 μL连续进样6次,测定其峰面积积分值,考察精密度。

稳定性实验:精密吸取姜黄素类化合物对照品溶液20 μL,分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h测定其峰面积,考察其稳定性。

样品重复性实验:取同批姜黄粉末和饮料样品各5份,分别按照1.2.3样品处理的方法处理后进样分析,以色谱峰峰面积为指标计算RSD,考察方法的重复性。

加标回收率实验:精密称取已知含量的同批姜黄粉末和饮料各9份,分别加入样品中各成分含有量的80%、100%、120%的对照品,按照1.2.3样品处理的方法制备所需溶液并进行分析,以色谱峰峰面积为指标计算各种姜黄素类化合物的回收率[18]。

2 结果与讨论

2.1 HPLC检测姜黄素类化合物色谱条件的确定

2.1.1 检测波长的选择 在190～800 nm波长下分别对姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素标品溶液进行扫描,发现姜黄素类化合物在254 nm左右和425 nm左右均有较大吸收峰,但是根据文献[22-24]报道,在254 nm左右波长下有杂质干扰,并且灵敏度较低,需要进样量大,因此本法选用425 nm为检测波长。

2.1.2 流动相的选择及其流速、pH的确定 本实验选择流动相为乙腈和水,并分别选用冰乙酸、甲酸、磷酸、三氟乙酸调节水溶液的pH。实验结果证明采用这四种酸性试剂调节水溶液pH在2.5～4.0范围内对于姜黄素类化合物的分离效果没有显著差异。考虑到冰乙酸、甲酸以及三氟乙酸都属于挥发酸,调节后pH不稳定,并且三氟乙酸属于强酸,有强烈腐蚀性,所以选择乙腈-磷酸水溶液作为流动相。

随着流动相流速的提高,姜黄素类化合物的出峰时间明显提前,并且峰底变窄,当流动相流速为1.0 mL/min时具有较好的峰形。随着流动相pH的降低,分离度增大,当pH3.0时分离度趋于平缓,但是较低的pH对色谱柱会造成破坏,所以选择流动相pH3.0,此时分离效果较好。

表3 姜黄素类化合物的回归方程、线性范围及检出限Table 3 Regression equation,linear range and limit of quantification of curcuminoids

2.1.3 柱温的确定 色谱柱的温度影响流动相的传质速率。随着柱温的升高,传质速率提高,但是柱温的选择还要考虑到被检测物质的性质等。在温度梯度实验中,姜黄类化合物的分离效果差别不大,综合考虑柱温选择为30 ℃。

2.1.4 姜黄素类化合物分离的色谱条件的确定 姜黄素类化合物分离的最优色谱条件和梯度洗脱程序分别见表1和表2。

表1 姜黄素类化合物分离的色谱条件Table 1 Chromatographic separation conditions of curcuminoids compounds

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution programs

按照表1和表2所示条件对姜黄素类化合物对照品进行分析,此时姜黄素类化合物能够达到良好的分离,并且具有良好的峰形(结果见图1)。

图1 姜黄素类化合物的对照品溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of standard curcuminoids注:1:双去甲氧基姜黄素;2:去甲氧基姜黄素;3:姜黄素。

2.2 姜黄素类化合物标准曲线的建立和方法学的考察

2.2.1 姜黄素类化合物标准曲线的绘制 按照1.2.5.1操作,配制不同浓度梯度的姜黄素类化合物对照品溶液,在最优色谱条件进行HPLC分析,得出姜黄素类化合物的线性回归方程、线性范围、相关系数R2与检出限(LOD),结果见表3。

2.2.2 方法学的考察 方法学的考察实验包括精密度实验、稳定性实验、重复性实验以及加标回收率实验,结果见表4。

表4 精密度、稳定性、重复性以 及加标回收率实验结果Table 4 Test results of precision,stability, repeatability and recoveries of spiked standard

2.3 不同种类的姜黄根茎和姜黄素饮料中姜黄素类化合物的测定

精确吸取20 μL样品处理溶液,按1.2.4中色谱条件测定其中姜黄素类化合物含量,不同种类的姜黄根茎测定结果见图2和表5;不同种类的姜黄素饮料测定结果见图3和表6。

图2 姜黄根茎提取液色谱图Fig.2 Chromatograms of turmeric rhizome extract

表5 姜黄根茎样品测定结果(n=3)Table 5 Analysis results of actual sample of Curcuma longa L(n=3)

表6 姜黄素饮料样品测定结果(n=3)Table 6 Analysis results of actual sample of curcumin beverage(n=3)

图3 饮料中姜黄素类化合物色谱图Fig.3 Chromatograms of curcuminoids in beverage

由表5数据结果分析,不同地区生长的姜黄中所含姜黄素类化合物的含量不同。在所分析的姜黄根茎中姜黄素类化合物含量最高的印度二批的姜黄,其次是缅甸三批的姜黄、印度一批的姜黄,含量最低的是四川姜黄。然而姜黄素在姜黄素类化合物中所占的比例最大的是印度一批姜黄,为63.05%,其次是四川姜黄,所占比例为62.27%,再次是印度二批和缅甸一批,所占比例分别是59.18%和56.92%。去甲氧基姜黄素含量最高的是印度二批姜黄,其次是缅甸三批和缅甸二批。双去甲氧基姜黄素含量最高的是缅甸三批,其次是缅甸二批和印度二批。另外,印度二批的姜黄中所含的姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素的含量所占比例大致相同。

由表6数据分析可知,所研究的4种姜黄素饮料中主要的姜黄素类化合物成分均是姜黄素,分别约占姜黄素类化合物总量的87.5%、85.6%、87.8%和82.8%。其中,市售姜黄素饮料中种类2中的去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素的含量最高,而市售姜黄素饮料种类3中的姜黄素含量最高。

虽然这3种姜黄素类化合物在结构上相近,很多生理活性相似,但是由于它们在结构上烷氧基的微小差异,使其在生理功效上也有所不同[23,25],例如在抑制血管平滑肌细胞的增殖、动脉粥样硬化的形成方面最强的是姜黄素,其次是去甲氧基姜黄素[26];在抑制人内皮细胞生长增殖作用活性最强的是双去甲氧基姜黄素[27]。在抑制脂质过氧化方面,活性强弱顺序依次是姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素[28]。因此,不同种类的姜黄素饮料其中的各姜黄素类化合物的含量有所不同,其保健的侧重点也不相同。

3 结论

本研究建立了利用HPLC方法分析检测姜黄根茎及饮料中姜黄素类化合物的方法,优化了色谱条件。该方法操作简单,并且具有较高的准确性和精密性,能够同时测定姜黄根茎及饮料中3种姜黄素类化合物的含量,为保健品中姜黄素类化合物的测定提供了参考依据。

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High-performance liquid chromatography method for quantitative determination of curcuminoids in rhizomes ofCurcumaLongaL. and curcumin beverage

SUN Peng-yao,LI Dan-dan,MO De-hua*

(College of Bioscience and Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China)

AHPLCmethodwasestablishedforthedeterminationofcurcuminoidscontentinrhizomesofCurcuma Longa L.andcurcuminbeverage.Thesampleswereextractedinethanolbyultrasonictreatment.ThedeterminationbyRP-HPLCwascarriedoutusingDIKMAPlatisilODScolumn(4.6mm×250mm,5μm)andacetonitrile-water(pH=3.0adjustedbyphosphoricacid)withgradientelutionataflowrateof1mL/min.TheUVdetectionwavelengthwas425nmandthecolumntemperaturewassetat30 ℃.Thecalibrationcurveswerelinearintherangeof1.00～200.00,0.96～192.00,0.96～192.00mg/L(R2>0.999)forcurcumin,demethoxycurcuminandbisdemethoxycurcumin.Theaveragerecoverieswere106.87%(RSD=1.24%),105.28%(RSD=0.48%)and96.86%(RSD=0.26%),respectively.Themethodwassimple,rapidandreproducible,andcanbeusedforthedeterminationofcurcuminoidsinrhizomesofCurcuma longa L.andcurcuminbeverage.

HPLC;Curcuma longa L.;beverage;curcuminoids;contentdetermination

2016-04-25

孙鹏尧(1990-)，女，在读硕士研究生，研究方向：食品科学与工程，E-mail:spy_yao@163.com。

*通讯作者:牟德华(1960-)，男，本科，教授，研究方向：农产品加工，E-mail:dh_mou@163.com。

TS207.3

A

1002-0306(2016)21-0313-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.052