草菇子实体GC-MS分析及不同极性部位体外抗氧化活性研究

秦惠娟,杨健华,陈 屏,张 晶,王 琦，*

(1.吉林农业大学中药材学院,吉林长春 130118;2.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心,吉林长春 130118)



草菇子实体GC-MS分析及不同极性部位体外抗氧化活性研究

秦惠娟1,2,杨健华2,陈 屏2,张 晶1，*,王 琦2，*

(1.吉林农业大学中药材学院,吉林长春 130118;2.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心,吉林长春 130118)

目的:研究草菇乙醇提取物不同极性部分的抗氧化活性及子实体GC-MS分析。方法:用95%的乙醇回流提取草菇,依次用有机溶剂萃取获得石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层4个不同极性部位。以2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)为对照,分别考察其总抗氧化能力、DPPH自由基清除活性、铁离子还原能力、ABTS自由基清除活性,比较草菇乙醇提取物不同极性部位的抗氧化作用。结果:通过GC-MS分析,分析出49个化合物,以烷烃类、脂肪酸类、醛类、酯类、酮类为主,含量分别为22.54%、19.94%、15.38%、13.08%、7.33%。通过四种体外抗氧化能力的测定,草菇乙醇提取物的不同极性部位均有抗氧化活性,其中乙酸乙酯层和正丁醇层表现出较好的抗氧化活性,氯仿层的抗氧化活性最弱。在所设定浓度范围内,其乙酸乙酯层的总抗氧化能力、DPPH自由基清除率、铁离子还原能力明显高于其它层(p<0.05)。在ABTS自由基清除体系中,正丁醇层的ABTS自由基清除率高于乙酸乙酯层,但差异不显著(p>0.05)。结论:通过对草菇子实体GC-MS分析及抗氧化活性测试,草菇提取物的乙酸乙酯层和正丁醇层的抗氧化作用强,是天然抗氧化剂的良好来源,应对其进一步分离纯化。

草菇,总抗氧化能力,DPPH,铁离子还原能力,ABTS

草菇(Volvariellavolvacea(Bull. ex Fr.)Sing.),别名麻菇、秆菇、家蕈、贡菇、稻草菇、兰花菇,隶属于担子菌门(Basidiomycota),伞菌亚纲(Agaricomycetidae),伞菌目(Agricales),光柄菇科(Pluteaceae),小苞脚菇属(Volvariella)[1],是热带和亚热带地区夏季生长的一种腐生真菌。草菇的化学成分复杂,目前从该属真菌中已分离得到草菇多糖[2]、凝集素[3]、蛋白[4]、氨基酸、三萜类化合物[5]、甾醇[6]等多种成分。经常食用草菇有利于提高人体的免疫力,促进机体的新陈代谢,增强机体的抗病能力[7-8]。有报道草菇水提取物中总酚和多糖含量最高,具有较高的DPPH自由基清除活性[9]。但关于其抗氧化活性部位的筛选,少有研究。

本文通过GC-MS分析草菇子实体的组成成分,并采用总抗氧化能力、DPPH、铁离子还原能力、ABTS四种体外抗氧化模型对草菇的石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层4个极性部位的抗氧化活性进行研究,为进一步研究开发草菇提取物的抗氧化功效提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草菇子实体(冻干样品) 江苏江南生物科技有限公司,经吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心王婉博士鉴定为光柄菇科,小苞脚菇属草菇Volvariellavolvacea(Bull. ex Fr.)Sing.的子实体;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,纯度≥97%)、ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐,纯度≥98%)、TPTZ(2,4,6-三吡啶基三嗪,纯度≥98%)、BHT(2,6-二叔丁基二甲酚,纯度≥99%)上海金穗生物科技有限公司;三水合乙酸钠 西陇化工股份有限公司;磷酸三钠、钼酸铵、过硫酸钾、氯化亚铁 天津市光复科技发展有限公司;石油醚(60～90 ℃)、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等 均为国产分析纯。

AL104型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SBL-15DT超声波恒温清洗机 宁波新芝生物科技有限公司;RE-3000旋转蒸发仪 上海亚荣生化有限公司;DK-4205三用恒温水箱 上海精宏实验设备有限公司;VORTEX-6电动振荡器 上海其林贝尔有限公司;去离子纯水系统Basic-QE15 上海和泰仪器有限公司;GC-MS-QP2010 SHMADZ;SpectraMax Plus384连续光谱扫描式酶标仪 美国分子仪器公司。

1.2 草菇提取物的制备

将草菇干燥子实体1 kg,粉碎,置于2000 mL的圆底烧瓶中,用95%乙醇回流提取3次,每次3 h,料液比1∶4。减压浓缩后分散至水中,分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取至有机溶剂无色,分别合并各溶剂萃取液,干燥至恒重。将各萃取物分别用无水乙醇配置成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的样品溶液备用。

1.3 GC-MS分析

1.3.1 色谱条件 石英毛细管柱-5MS,30 m×0.25 mm×0.25 μm。升温程序从60 ℃开始,保持1 min,以10 ℃/min升至280 ℃,保持50 min,进样量1 μL,分流比1∶40,载气为He,柱流量1.0 mL/min,进样口温度280 ℃。

1.3.2 质谱条件 EI源,电离电压75 eV,离子源温度200 ℃,扫描范围20～800 amu。

1.4 总抗氧化能力的测定

采用钼酸铵法对草菇不同极性部位进行总抗氧化能力的测定[10-11]。钼酸铵反应体系的配制:2.13 g磷酸钠、0.99 g四水合钼酸铵、6.67 mL浓硫酸溶于200 mL的蒸馏水中,使各浓度依次为28、4和6 mol/L,混合均匀。将0.3 mL不同浓度(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL)的样品溶液和BHT加入到3 mL的钼酸铵反应体系中,将混合液混匀并于95 ℃恒温水浴90 min,待反应液冷却后,取200 μL各混合溶液加入到96孔板中,于695 nm处测定吸收值。以不加样品的空白试剂调零,BHT为阳性对照,每个样品平行测定3次。

1.5 DPPH自由基清除活性的测定

[12-13]称取10.6 mg DPPH,用无水乙醇定容于100 mL容量瓶中,使其浓度为0.1 mol/L,避光保存(0～4 ℃),备用。取2.0 mL不同质量浓度的样品溶液和2.0 mL的0.1 mol/L DPPH溶液混合于10 mL试管中,摇匀,避光反应30 min,取200 μL各混合溶液加入到96孔板中,然后在517 nm处测定吸光值,以等量的无水乙醇作为空白对照,BHT为阳性对照,每个样品平行测定3次。根据以下公式测定DPPH自由基清除率:

DPPH自由基清除率(I)=(1-As/A0)×100

式中As为样品管中的吸光值;A0为空白管中的吸光值。

1.6 铁离子还原能力的测定

采用FRAP法[14]。称取5.100 g三水合乙酸钠加入20 mL的冰醋酸,用超纯水定容至250 mL,溶解摇匀,使其浓度为0.3 mol/L,置于避光处,备用。称取31.2 mg TPTZ,用40 mmol/L的浓盐酸定容至10 mL,溶解摇匀,使其浓度为10 mmol/L,置于避光处,备用。称取2.030 g FeCl2·4H2O,加入25 mL的超纯水,溶解摇匀,使其浓度为0.3 mol/L,置于避光处,备用。以上三种溶液按体积比例10∶1∶1混合配制成FRAP工作液。于5 mL试管中加入0.2 mL不同浓度(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL)的样品溶液和BHT,再加入2 mL的FRAP工作液,振荡摇匀,室温、避光静置10 min。取200 μL各混合溶液加入到96孔板中,于593 nm处测定吸收值。以等量的无水乙醇作为空白对照,BHT为阳性对照,每个样品平行测定3次。

表1 草菇子实体GC-MS分析Table 1 GC-MS analysis of V. Volvacea fruiting bodies

1.7 ABTS自由基清除活性的测定

参考文献[15-16],称取0.0384 g ABTS,用去离子水溶解,定容于20 mL的容量瓶中,使其浓度为14 mmol/L,待用。称取0.0134 g过硫酸钾用去离子水溶解,定容于10 mL的容量瓶中,使其浓度为2.45 mmol/L,待用。以上两种溶液按体积比例1∶1混合摇匀,并将该混合液避光反应 12～16 h,将生成ABTS自由基溶液用磷酸缓冲液(PBS,0.01 mol/L,pH7.4)稀释至734 nm处吸光值为0.70±0.02。于5 mL试管中加入100 μL不同浓度(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL)的样品溶液和BHT,再加入2 mL的ABTS反应液,振荡摇匀,室温放置10 min。取200 μL各混合溶液加入到96孔板中,于734 nm处测定吸收值。以等量的无水乙醇作为空白对照,BHT为阳性对照,每个样品平行测定3次。根据以下公式测定ABTS自由基的清除率:

ABTS自由基清除率(I)=(1-AS/A0)×100

其中AS为样品管的吸光值;A0为对照管的吸光值。

1.8 统计学分析

所有实验重复测定三次,并采用 SPSS19.0软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 GC-MS分析

图1 草菇子实体气质分析总离子流图Fig.1 Total ion current(TIC)chromatogram of V. Volvacea fruiting bodies

通过草菇子实体GC-MS分析了解其化学成分,总离子流图如图1所示。通过NIST02、WILEY库进行自动检索与标准物质质谱图进行对比分析,并结合质谱裂解规律确定其化学成分,同时运用峰面积归一法计算各组分相对百分含量,见表1。从草菇子实体中分析出49个化合物,其中包含烷烃类、脂肪酸类、醛类、酯类、酮类及其它,含量分别为22.54%、19.94%、15.38%、13.08%、7.33%、19.75%,占检识出总量的78.27%。结果表明草菇子实体中以脂肪烃及脂肪酸为主要成分,含量较多的是十六烷(5.93%)、十四烷(3.99%),十六酸(6.59%)、乙酸(2.57%)、肉豆蔻酸(3.15%)、十六烯酸(2.09%)。其中脂肪酸中存在很多的抗氧化物质,如不饱和脂肪酸亚油酸、(z)-11-十六烯酸、13-十八碳烯酸,十六烷酸等。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 草菇提取物各极性部位的总抗氧化能力 磷钼酸铵被具有抗氧化性的物质还原,获得磷钼络合物,在695 nm处有最大吸收。由图2可知,草菇不同极性部位均具有较好的还原能力。随着样品浓度的增加,各产物吸光度均逐渐增大,说明随着浓度的增大各极性部位的总抗氧化能力均成增加趋势。BHT与各极性部位的抗氧化性存在显著性差异(p<0.05),TAC大小依次为:BHT>乙酸乙酯层>正丁醇层>石油醚层>氯仿层,其中正丁醇层和石油醚层差异不显著(p>0.05),但乙酸乙酯层的抗氧化性在同一浓度明显高于正丁醇层和石油醚层,这与张京芳[17]在香椿叶提取物不同极性部位体外抗氧化活性中乙酸乙酯层的总抗氧化能力强结果相一致。

续表

图2 草菇不同极性部位的总抗氧化活性Fig.2 TAC of different extract from V. volvacea

2.2.2 草菇提取物各极性部位的DPPH自由基清除能力 DPPH在乙醇中以一种以氮为中心的自由基稳定存在,成单一电子,溶液呈深紫色,在517 nm下有最大光吸收,加入抗氧化剂时,溶液颜色变浅,吸收减小,清除率升高,表明该物质清除自由基的能力越强。由图3可知,在同一浓度下,乙酸乙酯层对DPPH自由基的清除率最大,其次是正丁醇层、石油醚层、氯仿层。通过对实验数据进行拟合计算,乙酸乙酯层、正丁醇层、石油醚层和氯仿层的IC50分别为(0.64±0.10)、(0.89±0.03)、(1.71±0.12)、(2.58±0.24) mg/mL,BHT的IC50值为(0.40±0.01) mg/mL,表明草菇乙酸乙酯层清除DPPH自由基能力最强,其次为正丁醇层,当浓度达到3 mg/mL时,乙酸乙酯层对DPPH自由基清除率为91.39%,正丁醇层清除率则为85.48%,四个部位提取物的抗氧化能力均弱于阳性对照BHT。

图3 草菇不同极性部位对DPPH自由基的清除率Fig.3 DPPH radical scavenging activity of different extract from V. volvacea

2.2.3 草菇提取物各极性部位的铁离子还原能力 FRAP法是在低pH3.6的条件下,Fe3+与TPTZ形成复合物(Fe3+-TPTZ),在还原物质的作用下,复合物被还原为二价铁而呈明显的蓝色,在593 nm达最大吸收。由图4可知,草菇不同极性部位均表现出不同程度的还原能力,且都有明显的量效关系。它们的还原力大小依次为BHT>乙酸乙酯层>正丁醇相>石油醚层>氯仿层,其抗氧化性主要集中在极性大的部位。

图4 草菇不同极性部位的铁离子还原能力Fig.4 Fe3+ reduction abilitys of different extract from V. volvacea

2.2.4 草菇提取物各极性部位的ABTS自由基清除能力 ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色ABTS+·,在抗氧化物存在时ABTS+·的产生会抑制,在734 nm测定ABTS+·的吸光度,吸光值下降越剧烈,表现为清除ABTS+·的能力就越强。

由图5可知,草菇各部位提取物表现出的ABTS自由基清除活力对浓度呈正相关。其中,正丁

醇层的IC50值为(0.85±0.01) mg/mL,乙酸乙酯层、石油醚层和氯仿层提取物IC50分别为(1.04±0.21)、(1.59±0.02)、(2.76±0.13) mg/mL。当浓度达到3 mg/mL时,正丁醇层、乙酸乙酯层、石油醚层和氯仿层提取物物质的ABTS自由基清除率分别为90.39%、88.84%、70.87%、56.89%。ABTS自由基清除能力最强的正丁醇层,乙酸乙酯层和石油醚层次之,氯仿层的抗氧化能力最弱,四个部位提取物的抗氧化能力均弱于阳性对照BHT。

图5 草菇不同极性部位对ABTS+·的清除率Fig.5 ABTS radical scavenging activity of different extract from V. volvacea

3 结论

通过GC-MS 分析,分析出49个化合物。以烷烃类、脂肪酸类、醛类、酯类、酮类为主,含量分别为22.54%、19.94%、15.38%、13.08%、7.33%,占检识出总量的78.27%。

体外抗氧化实验结果表明,4个部位均具有不同程度的体外抗氧化活性,且在实验设定的浓度范围内,呈现较好的量效关系。在DPPH生成体系中,乙酸乙酯层和正丁醇层的IC50值分别为(0.64±0.01)、(0.89±0.03) mg/mL,DPPH的清除率大小依次为乙酸乙酯层>正丁醇>石油醚层>氯仿层。在ABTS生成体系中,其正丁醇层IC50值为(0.85±0.01) mg/mL,乙酸乙酯层和石油醚层提取物分别为(1.04±0.21) mg/mL和(1.59±0.02) mg/mL,氯仿层最低,ABTS自由基的清除率大小依次为正丁醇层﹥乙酸乙酯层﹥石油醚层﹥氯仿层。在同一浓度下,其总抗氧化能力和铁离子还原能力大小为乙酸乙酯层﹥正丁醇﹥石油醚层﹥氯仿层。说明乙酸乙酯层和正丁醇层的体外抗氧化能力较强,活性主要集中在中等极性和极性大的部位,这可能与乙酸乙酯和正丁醇的所含的活性成分有关。中小极性可能含有黄酮和多酚类化合物,而大极性主要以蛋白和多糖为主,值得重点进一步研究,可通过进一步分离分析,确定草菇抗氧化活性的主要物质基础。

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GC-MS analysis ofVolvariellavolvaceafruiting bodies and different solvent extracts antioxidant activitiesinvitro

QIN Hui-juan1,2,YANG Jian-hua2,CHEN Ping2,ZHANG Jing1，*,WANG Qi2，*

(1.College of Chinese Medicinal Materials,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;2.Engineering Research Centre of Chinese Ministry of Education for Edible and Medicinal Fungi,Changchun,Changchun 130118,China)

Objective:Toinvestigateantioxidantactivitiesin vitroofdifferentpolarityfractionsofethanolextractandGC-MSanalysisfromVolvariella volvaceafruitingbodies.Methods:Volvariella volvaceawasextractedwithvolumefractionof95%ethanolrefluxextraction,anddecompressedconcentratingtoobtainethanolextract,thenfourdifferentpolaritypartsofVolvariella volvaceaextractswerepreparedbytheadditionofpetroleumether,chloroform,ethylacetateandbutanollayer.Theantioxidantactivityin vitroofdifferentpolarpartsofVolvariella volvaceaextractswereinvestigatedbythetotalantioxidantcapacity,DPPHfreeradicalscavengingactivity,ferricreducingabilityandABTSradicalscavengingactivity,and2,6-ditertbutylatedhydroxytoluene(BHT)wasthecontrol.Results:49compoundswereanalyzedfromtheVolvariella volvaceafruitingbodiesbyGC-MSanalysis,whichmainlyincludedalkanes,fattyacids,aldehydes,esters,alcohols,ketones,andthecontentwasrespectively22.54%,19.94%,15.38%,13.08%,7.33%.Throughthedeterminationoffourin vitroantioxidantcapacity,strawmushroomethanolicextractsofdifferentpolarpartsallshowedantioxidantactivity,whichlayerofethylacetateandbutanollayershowedgoodantioxidantactivityandthechloroformlayerofantioxidantactivitywasthelowest.Withinthesetconcentrationrange,thetotalantioxidantcapacity,DPPHfreeradicalscavengingrateandironionreductionabilityoftheethylacetatelayerweresignificantlyhigherthanthoseofotherlayers(p<0.05).IntheABTSfreeradicalscavengingsystem,theABTSradicalscavengingrateofthenormalbutanollayerwashigherthanthatoftheethylacetatelayer,butthedifferencewasnotsignificant(p>0.05).Conclusions:ThroughtheanalysisofGC-MSandtestofantioxidantactivityofthefruitingbody,ethylacetatefractionandnormalbutylalcoholfraction,whichwereakindofgoodsourcefornaturalantioxidants,showedrelativelystrongantioxidantactivities,andwereworthseparatingandpurifyingfurther.

Volvariella volvacea;thetotalantioxidantcapacity;DPPH;ferricreducingability;ABTS

2016-04-08

秦惠娟(1990-)，硕士，主要从事药用真菌方面的研究，E-mail:18686635344@163.com。

*通讯作者:张晶(1971-)，女，博士，教授，主要从事天然产物化学研究，E-mail:zhjing0701@163.com。 王琦(1963-)，女，博士，教授，主要从事药用真菌方面的研究，E-mail:qiwang003@hotmail.com。

国家重点基础发展计划(2014CB138304)；国家科技支撑计划(2012BAC01B04)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)21-0318-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.053