iASPP基因在卵巢癌中的表达及其临床意义

高燕芳，蒋丽霞，张 铭

(南京医科大学附属常州市妇幼保健院检验科 213003)



论著·临床研究

iASPP基因在卵巢癌中的表达及其临床意义

高燕芳，蒋丽霞△，张 铭

(南京医科大学附属常州市妇幼保健院检验科 213003)

目的 检测iASPP在卵巢癌中的表达，探索其在卵巢癌中的致病机制。方法 收集2013年5月至2014年12月于常州市妇幼保健院行卵巢肿瘤切除术的患者的癌组织及对应癌旁组织标本共32份，用实时荧光定量聚合酶链反应法检测iASPPmRNA相对表达水平并分析它与卵巢癌临床病理特征的关系。结果 卵巢癌组织中iASPPmRNA水平明显高于癌旁组织(P=0.001)，并且与卵巢癌病理分期相关 (P<0.05)，iASPP表达水平与患者年龄、是否绝经、组织学类型、术前有无化疗、有无淋巴结转移、糖类蛋白125及糖类蛋白153表达情况无相关性，其差异无统计学意义(P>0.05)。结论iASPPmRNA在卵巢癌组织中高表达显示其在肿瘤发生过程中发挥重要作用。

卵巢肿瘤；iASPP;p53

卵巢癌是严重威胁妇女生命的女性生殖系统肿瘤之一，由于它极高的恶性程度及逐年上升的发病率，其致死率已居于妇科恶性肿瘤首位。众所周知，肿瘤的发生涉及多种基因，这些基因在不同阶段相继发挥作用，而细胞凋亡是这个过程中至关重要的一个环节，它对肿瘤的发生发展过程都具有十分重要的意义。现在许多肿瘤学研究都致力于细胞凋亡功能如何被调控及其发生异常的原因，目前已发现多种调控细胞凋亡的基因，找出这些基因在卵巢癌发生过程中的作用机制，将对卵巢癌的诊断与治疗有极其重要的意义。

p53凋亡刺激蛋白(apoptosis-stimulating protein of p53，ASPP)家族因为具有特异调控p53的的功能而被命名，是最近发现的一个蛋白家族。ASPP1、ASPP2和iASPP(inhibitory member of the ASPP family)是这个家族的主要成员。该家族的特征性结构是SH3结构域，C-末端的锚蛋白重复序列以及富含脯氨酸的结构域[1]。虽然3个家族成员的结构相似，但它们的功能却截然不同，其中ASPP1、ASPP2主要是与p53结合从而促进p53诱导的细胞凋亡；而iASPP则相反，它可以竞争性的与ASPP1、ASPP2结合p53蛋白来抑制p53的促细胞凋亡功能，因此具有癌基因的性质[1]。p53基因是一种较为重要的抑癌基因，研究显示它在卵巢癌的发生发展过程中发挥重要作用。由此可推测，iASPP有可能通过调节p53基因的表达，从而在卵巢癌中发挥重要作用。本研究用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测卵巢癌组织中iASPP的表达情况，分析它在卵巢癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本试验标本取自2013年5月至2014年12月于常州市妇幼保健院行卵巢肿瘤切除术的患者，术后标本均通过病理检查，最终证实为卵巢癌，共32例，组织学分类包括：22例浆液性腺癌，9例黏液性腺癌，1例透明细胞癌，患者平均年龄51岁(29～71岁)。癌组织及对应癌旁组织均于术中选取，肉眼下正常组织作为癌旁组织。术后新鲜组织用生理盐水冲洗2～3遍，继而被剪碎保存于组织冻存管中放在-80 ℃冰箱。

1.2 主要试剂 RNA分离及提取试剂购自美国 Invitrogen 公司，实时荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程有限公司,反转录-PCR试剂盒购自美国 Fermentas 公司，iASPP和β-actin引物购自上海生工公司。

1.3 方法

1.3.1 组织标本中总mRNA的提取 将50～100 mg组织用匀浆机打碎，加入Trizol裂解并提取mRNA。用紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度，分析所提取mRNA质量，选取纯度较高者继续进行RT-PCR反应。

1.3.2 第1链cDNA的合成 参照反转录PCR试剂盒说明书进行第1链cDNA的合成。逆转录反应体系为20 μL，分别为DEPC 9 μL，5×逆转录缓冲液4 μL，随机引物Oligo 1 μL，dNTP 2 μL，逆转录酶1 μL，RNA模板3 μL。最后转到PCR扩增仪(Thermo)上25 ℃ 10 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。储存第1链cDNA于4 ℃冰箱或立即行PCR。

1.3.3 引物设计和合成 根据Genebank的基因序列，设计引物并对其特异性进行比较。iASPP引物序列为：上游5′-GGC GGT GAA GGA GAT GAA C-3′ ；下游5′-TGA TGA GGA AAT CCA CGA TAG AG-3′。β-actin内参基因引物序列为：上游5′-GGC GGC ACC ACC ATG TAC CCT-3′ ；下游5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3′ 实时荧光定量PCR在荧光定量PCR仪 Light Cycler1.5(Roche)上检测，反应体系为20 μL，分别为：第1链cDNA 2 μL，2×SYBR Green Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，去离子水7.0 μL。反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，收集荧光，40个循环。溶解曲线反应条件：95 ℃ 10 s，60 ℃1 min，95 ℃10 s。产物经2%琼脂糖电泳分离，判断扩增产物特异性。

1.4 统计学处理 实验数据用SPSS16.0统计软件进行统计分析。卵巢癌组织与癌旁组织间iASPP mRNA表达水平的差异用秩和检验进行分析；Mann-Whitney U-test分析iASPP mRNA相对表达量与卵巢癌临床特征是否相关，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 扩增特异性 iASPP和β-actin两种扩增产物的溶解曲线呈单一峰，溶解温度与产物的预期溶解温度相符(图1)。

图1 iASPP与β-actin扩增产物溶解曲线

2.2 iASPP在卵巢癌及对应癌旁组织中的表达 与癌旁组织相比，iASPP mRNA在卵巢癌组织中的表达量明显偏高，差异有统计学意义(P=0.001)，见图2。

2.3 iASPP mRNA表达与卵巢癌临床病理特征的关系 统计分析显示，iASPP mRNA卵巢癌不同临床分期中的表达，Ⅰ期与Ⅱ、Ⅲ期相比，差异有统计学意义(P<0.05)。iASPP mRNA与卵巢癌患者的年龄、是否绝经、肿瘤组织学类型、术前有无化疗、有无淋巴结转移、CA125及CA153水平的差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 iASPP mRNA在卵巢癌组织中的相对表达水平

特征nP年龄<51岁170.710≥51岁15绝经否190.426是13组织学类型浆液性腺癌220.375囊液性腺癌9透明细胞癌1临床分期Ⅰ期120.002Ⅱ～Ⅲ期20淋巴结转移无200.924有12术前化疗否200.893是12CA125阴性50.285阳性27CA153阴性160.468阳性16

3 讨 论

细胞凋亡是细胞为维持内环境稳态而自主进行的有序死亡的过程，肿瘤形成和发展的一个重要原因就是细胞凋亡功能异常进而导致细胞过度增生。p53是一个重要抑癌基因，细胞受到DNA损伤、辐射等一系列物理或化学刺激后，p53基因就会被激活，继而作用于其下游基因引起一系列反应：首先，DNA损伤后p53表达迅速上升，诱导p21转录水平提高，将细胞周期抑制在G1期，这样细胞在进入S期之前通过DNA损伤修复系统修复损伤的DNA就有了足够的时间；其次，若损伤太大导致无法修复时，p53会通过诱导Bax等凋亡基因的表达使其加速细胞凋亡过程，从而抑制广泛性DNA损伤的细胞通过克隆性生长引发肿瘤。

iASPP由人类PPP1Rl3L基因编码[1]。全长的iASPP由828个氨基酸构成，细胞质和细胞核中均有表达[2]。一系列研究均已证实iASPP对p53具有负性调节功能。近年来，随着对iASPP研究的不断深入，已发现iASPP在宫颈癌[3]、神经胶质瘤[4]、大肠癌[5]、口腔鳞状细胞癌[6]、前列腺癌[7]等多种肿瘤组织中表达偏高。本研究用实时荧光定量PCR技术分析卵巢癌组织及相应的癌旁组织中iASPP mRNA的相对水平，结果显示：卵巢癌组织中的iASPP表达量相比癌旁组织明显升高；iASPP在卵巢癌组织中的表达量与卵巢癌临床分期有关。Cao等[8]研究还发现子宫颈癌中iASPP表达水平升高还与肿瘤放化疗抵抗相关。Liu等[9]等指出iASPP表达升高与头颈肿瘤预后差相关。这些都表明iASPP在肿瘤的发生过程发挥了重要作用。

p53是一个重要的抑癌基因，在人类肿瘤中，有一部分肿瘤的p53基因发生突变，导致它促细胞凋亡功能异常而引发肿瘤；然而还有一部分肿瘤的p53基因结构是正常的，即野生型p53，那么这些肿瘤中的p53为什么没有抑制癌症发生，研究证明，这些肿瘤细胞中存在着抑制p53的物质使p53的功能丧失。据统计，在卵巢癌中p53的突变率可达到50%[10]，然而仍有一部分肿瘤表达野生型p53，在这些肿瘤中，正常的p53抑癌功能被抑制从而导致肿瘤发生。iASPP能特异性抑制p53，若解除这种抑制作用，就有可能使肿瘤得到有效治疗。研究指出MiR-124能直接作用于iASPP从而抑制肿瘤的生长和侵袭，包括肠癌、恶性胶质瘤和前列腺癌[11-13]，但是否在卵巢癌中也起作用有待进一步研究。除此之外，A34可直接与iASPP结合并完全抑制iASPP对p53的作用[14]。随着医学水平的提高，基因诊断及基因治疗已成为肿瘤诊断与治疗过程中不可或缺的手段，本研究显示iASPP在卵巢中致病过程中发挥重要作用，可能为卵巢癌的诊断与治疗提供了一个新方向。

[1]Bergamaschi D,Samuels Y,O′Neil NJ,et al.iASPP oncoprotein is a key inhibitor of p53 conserved from worm to human[J].Nat Genet,2003,33(2):162-167.

[2]Slee EA,Gillotin S,Berqamaschi D,et al.The N-terminus of a novel isoform of human iASPP is required for its cytoplasmic localization[J].Oncogene,2004,23(56):9007-9016.

[3]Kong F,Shi X,Li H,et al.Increased expression of iASPP correlates with poor prognosis in FIGO IA2-IIA cervical adenocarcinoma following a curative resection[J].Am J Cancer Res,2015,5(3):1217-1224.

[4]Liu X,Kang J,Liu F,et al.Overexpression of iASPP-SV in glioma is associated with poor prognosis by promoting cell viability and antagonizing apoptosis[J].Tumour Biol,2016,37(5):6323-6330.

[5]Saebø M,Skjelbred CF,Nexø BA,et al.Vogel U,Kure EH.Increased mRNA expression levels of ERCC1,OGG1 and RAI in colorectal adenomas and carcinomas[J].BMC Cancer,2006(6):208-215.

[6]Kim JW,Roh JL,Park Y,et al.Cytoplasmic iASPP expression as a novel prognostic indicator in oral cavity squamous cell carcinoma[J].Ann Surg Oncol,2015,22(2):662-669.

[7]Zhang B,Xiao HJ,Chen J,et al.Inhibitory member of the apoptosis-stimulating protein of p53 (ASPP) family promotes growth and tumorigenesis in human p53-deficient prostate cancer cells[J].Prostate Cancer Prostatic Dis,2011,14(3):219-224.

[8]Cao L,Huang Q,He J,et al.Elevated expression of iASPP correlates with poor prognosis and chemoresistance/radioresistance in FIGO Ⅰb1-Ⅱa squamous cell cervical cancer [J].Cell Tissue Res,2013,352(2):361-369.

[9]Liu Z,Zhang X,Huang D,et al.Elevated expression of iASPP in head and neck squamous cell carcinoma and its clinical significance [J].Med Oncol,2012,29(5):3381-3388.

[10]Alvarez AA,Axelrod JR,Whitaker RS,et al.Thrombospondin-1 expression in epithelial ovarian carcinoma:association with p53 status,tumor angiogenesis,and survival in platinum-treated patients [J].Gynecol Oncol,2001,82(2):273-278.

[11]Liu K,Zhao H,Yao H,et al.MicroRNA-124 regulates the proliferation of colorectal cancer cells by targeting iASPP[J].Biomed Res Int,2013:867537-867548.

[12]Zhao WH,Wu SQ,Zhang YD.Downregulation of miR-124 promotes the growth and invasiveness of glioblastoma cells involving upregulation of PPP1R13L [J].Int J Mol Med,2013,32(1):101-107.

[13]Chen J,Xiao H,Huang Z,et al.MicroRNA124 regulate cell growth of prostate cancer cells by targeting iASPP[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(5):2283-2290.

[14] Qiu S,Cai Y,Gao X,et al.A small peptide derived from p53 linker region can resume the apoptotic activity of p53 by sequestering iASPP with p53[J].Cancer Lett,2014,356(2):910-917.

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Expression of iASPP gene in ovarian cancer and its clinical significance*

GaoYanfang,JiangLixia△,ZhangMing

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedChangzhouMunicipalMaternalandChildHealthCareHospital,NanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu213003,China)

Objective To detect the expressions of iASPP in ovarian cancer and to investigate its pathogenic mechanism in ovarian cancer.Methods Totally 32 pair samples of ovarian cancer tissues and corresponding paracancerous tissues were collected in our hospital from May 2013 to December 2014.The iASPP mRNA relative expression level was detected using real-time PCR (RT-PCR).Its relation with the clinicopathological characteristics of ovarian cancer was analyzed.Results The iASPP mRNA level in ovarian cancer tissues was significantly higher than that in the paracancerous tissues (P=0.001) and which was associated with the pathological stage(P<0.05).The iASPP expression had no correlation with the age,menopause,histological subtype,preoperative chemotherapy,lymph node metastasis and expression level of CA125 and CA153,the differences were not statistically significant.Conclusion The high expression of iASPP in ovarian cancer tissues reveals its important role in the tumor occurrence process.

ovarian neoplasms；iASPP;p53

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.31.012

常州市卫生计生委指导性科技项目(WZ201515)。

高燕芳(1985-)，硕士，住院医师，从事肿瘤标志物方面研究。△

，E-mail:jlx60003@163.com。

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A

1671-8348(2016)31-4357-03

2016-02-26

2016-04-14)