黑龙江省部分地区PEDV和TGEV流行病学调查

窦海艳 秦立鑫 张智明 杨朋欣 李鑫 丁国杰/哈药集团生物疫苗有限公司

黑龙江省部分地区PEDV和TGEV流行病学调查

窦海艳 秦立鑫 张智明 杨朋欣 李鑫 丁国杰/哈药集团生物疫苗有限公司

自2010年冬季开始，我国大部分省份的猪群出现了严重的仔猪腹泻疫情，临床症状主要表现为猪水样腹泻、呕吐和脱水等症状，其发病率与死亡率均很高，1周内的仔猪一旦发病，死亡率往往可达80%～100%，即使康复也生长缓慢，致使饲料报酬降低。截止到目前，仍有一部分规模化养殖户未能得到有效控制，给我国养猪业，尤其是规模化养猪场造成了巨大的经济损失。许多的学者研究表明，此次疫情主要是由以猪流行性腹泻病毒为主要病原引起的猪病毒性腹泻病。为进一步研究黑龙江省猪病毒性腹泻病原的流行现状，本研究对2015年1月至2015年12月采集于黑龙江省部分县市具有明显腹泻症状的发病猪的67份粪便样品进行了PEDV和TGEV的生物学检测，并对检测结果进行了单独感染情况和混合感染情况进行了统计和分析，旨在为黑龙江省猪病毒性腹泻的诊断和防控提供参考资料。

一、材料和方法

（一）材料

1. 样品。2015年1月至2015年12月，采集黑龙江省哈尔滨周边养猪场、肇东县、绥化地区、牡丹江市具有明显腹泻症状发病猪的粪便样品，共计67份，-20℃保存备用。

2. 参考病毒。猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒均由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心实验室保存。

3. 主要试剂。病毒基因组DNA/RNA核酸提取试剂盒，北京博迈德生物科技有限公司产品；M-MLV反转录酶、rTaq酶、dNTP、DNA标准DL2000，宝生物（大连）有限公司产品。

（二）方法

1. 引物的设计与合成。按参考文献的引物序列进行合成，由生工（上海）生物科技有限公司完成，见表1。

表1 引物序列

2. 样品的处理及核酸提取。将采集的粪便样品与灭菌PBS以1∶5的比例（质量体积比）混合，反复冻融3次后，以10 000 r/m离心10 min后，取上清200 ul，按照病毒基因组DNA/RNA核酸提取试剂盒说明书提取RNA。

3. 反转录及PCR扩增。按参考文献建立的方法进行。

4. 扩增产物的检测。取RT-PCR产物6 uL与1 uL上样缓冲液混匀，于1% 琼脂糖凝胶中电泳后，凝胶成像系统扫描鉴定扩增产物。

5. 结果判定与分析。根据检测结果，分别统计所采集样品中PEDV和TGEV的阳性数，并分别对PEDV和TGEV感染的阳性率、单独感染阳性率和混合感染率进行统计和分析。

二、结果

1. 样品PEDV和TGEV的RT-PCR检测结果。应用RT-PCR方法对采集于黑龙江省部分县市具有明显腹泻症状的发病猪的67份粪便样品进行检测，结果如表2所示，PEDV阳性样品49份，阳性率为73.2%，TGEV阳性样品19份，阳性率为 28.4%，以上2种病原均为阴性的样品10份，占样品总数的14.9%。以上结果表明，黑龙江省部分地区存在导致猪病毒性腹泻的PEDV和TGEV这两种抗原的流行，且以PEDV的感染更为突出。

表2 样品PEDV和TGEV的RT-PCR检测结果

2. 样品的单独感染及混合感染统计结果。按照检验结果对所采集的所有67份样品中PEDV和TGEV的单独感染和混合感染进行分别统计，统计结果如表3所示，PEDV单独感染38份，单独感染率为56.7%；TGEV单独感染8份，单独感染率为11.9%；PEDV/TGEV混合感染11份，混合感染率为16.5%。

表3 PEDV和TGEV单独和混合感染率统计结果

三、讨论

由传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的猪传染性胃肠炎(TGE)和由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪流行性腹泻(PED)，其临床表现、病理变化、流行病学等方面都极为相似，在临床和组织病理学上均难以区分，因此为确定是由哪种病原引发的猪腹泻，我国学者建立了国内检测区分TGEV和PEDV的多重RT-PCR的方法，可同时确诊是TGEV或PEDV或两者同时感染，从而达到诊断和鉴别的双重目的。本研究利用该方法对黑龙江省部分县市具有明显腹泻症状的发病猪的67份粪便样品进行检测，结果表明所采集样品主要以PEDV感染为主，TGEV感染较低，与我国目前两种病原的流行情况一致。同时从表2可以看出，两种病原的检出率在城市交通发达、人口密集的地区要高于交通欠发达、人口稀少的地区，由此推断现代交通和人口流动对这两种病原的扩散有着一定的推动作用。

本研究对样品PEDV和TGEV的单独感染情况及混合感染情况进行了统计。由表3的结果可以看出，在黑龙江省部分地区病毒性腹泻发生流行时，在以PEDV流行为主的同时，往往会存在PEDV和TGEV的混合感染，这就要求基层兽医工作者在疫病的防控工作中还应考虑是否存在混合感染情况，做到准确判定猪病毒性腹泻的致病原，加强混合感染的综合防控。同时，本研究的结果还为黑龙江省猪病毒性腹泻的诊断和防控提供参考资料。

（略）