不同腐烂程度毛竹篼成分及酶活研究

李美群，艾文胜，孟 勇，杨 明，涂 佳，蒲湘云，刘翔博

（湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004）

不同腐烂程度毛竹篼成分及酶活研究

李美群，艾文胜，孟 勇，杨 明，涂 佳，蒲湘云，刘翔博

（湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004）

对不同腐烂程度毛竹篼的成分及酶活进行分析，结果表明降解过程中各成分和酶活都呈现一定的规律和相关性。在降解过程中，灰分、热水抽出物、1%NaOH 抽出物、综纤维素、纤维素、酸不溶木质素最高值分别为32.39%、14.03%、48.13%、58.53%、41.45%、50.67%；最低值分别为3.32%、5.44%、27.70%、27.54%、24.67%、25.15%。滤纸酶活、棉花酶活、CMC纤维素酶活最高值分别为116.79×103U/kg、155.90×103U/kg、76.66×103U/kg。漆酶酶活、锰过氧化物酶活、木质素过氧化物酶活最高值分别为18.15×103U/kg、9.60×103U/kg、0.32×103U/kg。前、后期酶活都较低；中期物质丰富的时候，微生物大量生长、繁殖，酶活较高。

毛竹篼；纤维素酶；漆酶；锰过氧化物酶；木质素过氧化物酶

毛竹Phyllostachys heterocycla(Carr.) Mitford cv. pubescens是我国优良的材用竹，具有材性好、用途多和经济价值高等特点[1]。毛竹材在建筑、家具、造纸、包装、运输、食品、医药、保健、纺织、旅游、环保、化工、军工等行业得到广泛应用[2-4]。全国每年竹林采伐量6×106t以上，其中毛竹三亿根左右，约4.5×106t；然而毛竹林采伐后，剩下大量的毛竹篼，在自然环境中腐烂需要经过八年甚至十年才能被微生物降解[5]。毛竹篼含有大量纤维素、半纤维素和木质素，一般微生物难以降解，其中起主要作用的是纤维素降解菌和木质素降解菌。纤维素降解菌之所以能降解有机物，是其含有总纤维素酶、外切纤维素酶（Cl）以及内切纤维素酶（Cx）。木质素降解菌之所以能降解有机物，关键在于其分泌的胞外降解酶，主要有木质素过氧化物酶（Lignin Peroxidase，LiP）、漆酶（Laccase，Lac)和锰过氧化物酶（Manganese Peroxidase，MnP），这三种木质素降解酶均能单独降解木质素，也能两两联合，或者三种酶一起作用对木质素进行降解[6-8]。通过分析不同腐烂程度毛竹篼的成分变化以及纤维素酶活和木质素酶活变化来了解毛竹篼降解过程中的成分变化及酶活变化情况，希望能为毛竹篼降解微生物的筛选及快速降解提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料和设备

于10月在湖南省望城区原佳村乌山毛竹林场选取不同腐烂程度毛竹篼，按腐烂程度的不同定为1-10级。

FA2004B电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；FW177中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；DZF-6050真空干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；101-E型电热鼓风干燥箱，北京永光明医疗仪器厂；南凌冷柜SC/SD-338，佛山市南海百凌制冷设备厂；SX2-2.5-10箱式电阻炉，上海跃进医疗器械厂；SZC-D脂肪测定仪，上海纤检仪器有限公司；SHA-C水浴恒温震荡器，金坛市荣华仪器制造有限公司；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；SPECORD 210 PLUS紫外可见分光光度计，德国耶拿公司；医用离心机TD6-WS，长沙平凡仪器仪表有限公司。

1.2 试验地概况

试验地位于湖南省长沙市望城区原佳村乌山林场（112°40'～ 112°47′E，27°50'～ 28°17′N），海拔68～175 m，立竹度为2 595株/hm2，属中亚热带季风湿润性气候区，年均温17℃，年均降水量1 370 mm，日照1 610 h，无霜期274 d，1月平均最低气温为4.4℃，7月平均最高气温30℃。试验地土层厚＞80 cm，土壤pH值4.92、有机质含量平均值18.6 g/kg、碱解氮99 mg/kg、速效钾50.56 mg/kg、有效磷3.72 mg/kg。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄糖标准曲线

准确称取100.0 mg分析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至衡重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100 mL容量瓶中再定容到刻度，摇匀，浓度为l mg/mL。取10支试管，分别加0 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，l.0 mL，l.2 mL，l.4 mL，1.6 mL，1.8 mL葡萄糖标准溶液，补加蒸馏水到2.0 mL，加入2.0 mLDNS试剂混合均匀，在沸水浴中加热5 min取出后立即用水冷却到室温，定容到25 mL，摇匀，520 nm波长处测定OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）数为横坐标，用软件Origin7.0绘制标准曲线，形式为Y=ax+b。

1.3.2 纤维素、木质素粗酶液制备

取样品1 g，加9 mL无菌水，4℃浸提12 h，25℃，200 r/min振荡提取1 h，3 500 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液，用于测定滤纸纤维素酶活（FPA）、外切纤维素酶活（Cl）、内切纤维素酶活（Cx）、漆酶（Laccase）酶活、锰过氧化物酶（ MnP）酶活和木质素过氧化物酶（Lip）酶活，置4℃冰箱保存待用。

1.4 测定方法

总纤维素酶活（FPA）、外切纤维素酶活（C1）、内切纤维素酶活（CX）的测定方法[9]；锰过氧化物酶活的测定：2，6-DMP法[10-12]；漆酶酶活的测定：ABTS法[10-11,13]；木质素过氧化物酶活的测定：藜芦醇法[10-11,14]。

水分的测定：GB/T 2677. 2-93《造纸原料水分的测定》；灰分的测定：GB/T 2677. 3-93《造纸原料灰分的测定》；热水抽出物的测定：GB/T 2677.4-93《造纸原料水抽出物含量的测定》；1%氢氧化钠抽出物的测定：GB/T 2677. 5-93《造纸原料1%氢氧化钠抽出物含量的测定》；综纤维素的测定：GB/T 2677.10-1995《造纸原料综纤维素含量的测定》；酸不溶木质素的测定：GB/T 2677.8-94《造纸原料酸不溶木素含量的测定》；纤维素的测定：硝酸乙醇法[15]。

1.5 酶活计算

滤纸纤维素酶活、外切纤维素酶活、内切纤维素酶活力单位规定:1 mL反应液1 min水解生成1 umol葡萄糖的酶量为1个国际单位。

酶活计算公式：

式中x：样品OD值的平均值；a，b：由回归方程求出；n：酶液稀释倍数；T：酶液反应时间；0.5：所加酶液的量，mL。

漆酶酶活、锰过氧化物酶酶活和木质素过氧化物酶酶活单位（U）：上述条件下，每分钟催化1 umol2，6-DMP，ABTS或VA所需的酶量。计算中的ε470=49 600(mol·L-1cm)-1，ε420=36 000(mol·L-1cm)-1，ε310=9 300 000(mol·L-1cm)-1。

酶活计算公式：

式中V1，V2分别代表反应体系的总体积及反应酶液的体积；ΔA为吸光度的变化值，Δt为反应时间，ε为吸光系数，10：稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 不同腐烂程度毛竹篼理化成分

从表1可以看出，不同腐烂程度毛竹篼的化学成分是一个复杂、不断变化的过程，成分积累之后易被微生物生长、繁殖、氧化、合成所利用，降低之后微生物分解竹篼基质促使成分升高，直至后期剩下少量竹壁未被利用时（第10腐烂等级取样为少量竹壁）。

表1 不同腐烂程度毛竹篼的成分分析Table 1 The analysis of the ingredient of the bamboo stump on different decomposition degree

表2 不同腐烂程度毛竹篼成分与腐烂等级的相关性†Table 2 The correlation of ingredient and decomposition levels of the bamboo stump on different decomposition degree

灰分在前期略有波动，在第5腐烂等级时达到最低值为3.32%（本研究以干基计，全文同），中期升高幅度比较大，之后又降低，后期灰分含量升高。从表2可以看出，灰分与腐烂等级存在极显著正相关，可能是因为大分子物质被分解氧化以及流失到环境中后导致整体毛竹篼物质减少，而钾、钠、钙的无机盐类和二氧化硅等物质积累起来，以及毛竹篼的竹壁木质素一般最后才分解，所以灰分所占的含量偏高。随着毛竹篼的分解，营养物质的消耗、氧化等，后期灰分所占的比例越来越高，在第10腐烂等级时达到最高值为32.39%。在毛竹篼降解中，热水抽出物有3个升高和下降的过程，可见溶于水的物质是不断被分解和利用的。热水抽出物在第9腐烂等级时达到最高值为14.03%，在第10腐烂等级时达到最低值为5.44%，后期热水抽出物达到最低是毛竹篼被微生物分解、利用的差不多，基本只剩下少量竹壁没被完全利用。1%NaOH抽出物的含量在一定程度上说明原料受光热氧化或微生物等作用而变质或腐朽的程度。随着毛竹篼不断的降解，1%NaOH 抽出物的量基本上先逐渐升高然后下降，然后升高又下降，在第6腐烂等级时达到最高值为48.13%，在第1腐烂等级时达到最低值为27.70%。可见微生物在毛竹篼降解过程中，前期消耗的速度小于降解的速度，导致低分子量物质积累；中间有一个时期消耗的速度大于降解的速度，之后消耗速度降慢，低分子量物质积累；后期消耗的速度又大于降解的速度，低分子量物质减少。

从表1可以看出，综纤维素、纤维素、酸不溶木质素含量都处于不断降低和升高的变化过程中。综纤维素在第1腐烂等级时达到最高值为58.53%，在第8腐烂等级时达到最低值为27.54%。从表2可以看出，综纤维素与腐烂等级存在显著负相关，即随着腐烂等级的增加综纤维素含量降低，这说明在腐烂过程中综纤维素含量在所占的物质中总体比例减少，这是微生物分解和环境因素共同作用的结果。综纤维素与灰分、1%NaOH抽出物接近显著负相关，即综纤维素含量减少，灰分、1%NaOH抽出物含量增加，这说明大分子量的物质逐渐转化为小分子物质，符合物质增减平衡。

从表1可以看出，纤维素含量在第2腐烂等级时达到最高值为41.45%，在第7腐烂等级时达到最低值为24.67%。从表2可以看出，纤维素与综纤维素接近显著正相关，这说明在腐烂过程中综纤维素与纤维素含量总体变化趋势基本一致。从表1可以看出，酸不溶木质素在第5腐烂等级时达到最高值为50.67%，在第9腐烂等级时达到最低值为25.15%。从表2可以看出，酸不溶木质素与腐烂等级接近显著负相关，酸不溶木质素与灰分存在极显著负相关。在毛竹篼降解过程中酸不溶木质素随着腐烂等级的增加基本呈现出减少的趋势，酸不溶木质素含量的减少能极显著的导致灰分含量的增加。木质素使木质部维持极高的硬度以承拓整株植物的重量，因此，毛竹篼在后期变的疏松易烂可能与较低的木质素含量和高灰分含量有关。

2.2 葡萄糖标准曲线

绘制葡萄糖标准曲线如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线Fig. 1 The standard curve of glucose

2.3 不同腐烂程度毛竹篼的纤维素酶活

表3 不同腐烂程度毛竹篼的纤维素酶活Table 3 The cellulose enzyme activity of the bamboo stump on different decomposition degree

从表3和图2我们可以看出，在整个毛竹篼腐烂过程中，三种酶活在前期和后期比较低，中期比较高；棉花酶活高于滤纸酶活高于CMC纤维素酶活，酶活在降解过程中开始是轻微的降低或升高，之后达到最高值，然后开始降低，之后有轻微的降低或升高，在第10腐烂等级时都达到最低值。从表4可以看出，棉花酶活与滤纸酶活存在极显著正相关；CMC酶活与滤纸酶活存在极显著正相关，CMC酶活与棉花酶活接近显著正相关。从表3可以看出，棉花酶活在第3腐烂等级时达到最高值为155.90×103U/kg，滤纸酶活在第5腐烂等级时达到最高值为116.79×103U/kg，CMC纤维素酶活在第5级腐烂等级时达到最高值为76.66×103U/kg。棉花酶活、滤纸酶活、CMC纤维素酶活在第10腐烂等级时的最低值分别为：46.14×103U/kg、49.81×103U/kg、20.42×103U/kg。李超[8]采用竹腐材料为样品分离到的YJ-3菌固态发酵时CMC酶活、滤纸酶活、棉花酶活性分别能达到15.52 U/g，9.13 U/g，3.67 U/g，而F13几乎没有检测到纤维素酶活性。郝月等[16]从各种土壤及饲料中分离到12株能分解纤维素的菌株，测定的CMC酶活基本都大于FPA酶活大于天然纤维素酶活。马怀良等[17]从长期堆放稻草的土壤中分离出纤维素分解能力较强的霉菌菌株NM5，其C1酶活力、羧甲基纤维素酶活力、滤纸酶活力分别为 0.017 0、0.717 4、1.343 5 IU·mL-1。棉花酶活、CMC酶活与滤纸酶活在毛竹篼中都存在且酶活较高，而且极显著正相关，可见三种酶活的规律性较强。多样的纤维素酶有利于毛竹篼纤维素的降解，有规律的纤维素酶活变化可为毛竹篼的降解提供参考。

图2 不同腐烂程度毛竹篼的纤维素酶活变化曲线Fig. 2 The cellulose enzyme activity curve on different degree of rotting bamboo stump

2.4 不同腐烂程度毛竹篼的木质素酶活

从表5和图3我们可以看出，三种酶活在前期和后期比较低，中期比较高；漆酶酶活基本高于锰过氧化物酶活高于木质素过氧化物酶活，在第7和第9腐烂等级时锰过氧化物酶活高于漆酶酶活，酶活在毛竹篼腐烂过程中总是处于一个降低之后升高或升高之后降低的不断变化过程中。

表4 不同腐烂程度毛竹篼纤维素酶活与腐烂等级的相关性Table 4 The correlation of cellulose enzyme activity and decomposition levels of the bamboo stump on different decomposition degree

漆酶酶活在第4腐烂等级时达到最高值为18.15×103U/kg，在第7腐烂等级时达到最低值为0.63×103U/kg；锰过氧化物酶活在第7腐烂等级时达到最高值为9.60×103U/kg，在第6腐烂等级时达到最低值为0.66×103U/kg；木质素过氧化物酶活在第9级腐烂等级时达到最高值为0.32×103U/kg，在第10腐烂等级时达到最低值为0.0026×103U/kg。从表6我们可以看出，三种酶活不存在显著相关性。

表5 不同腐烂程度毛竹篼的木质素酶活Table 5 The lignin enzymes activity of the bamboo stump on different decomposition degree

图3 不同腐烂程度毛竹篼的木质素酶活变化曲线Fig. 3 The lignin enzymes activity curve of the bamboo stump on different decomposition degree

表6 不同腐烂程度毛竹篼木质素酶活与腐烂等级的相关性Table 6 The correlation of lignin enzymes activity and decomposition levels of the bamboo stump on different decomposition degree

很多菌株基本不产木质素酶，有些只产一种或两种，产三种木质素酶的很少。尹立伟等[18]在测定灰树花（珍稀食药用菌和白腐菌）木质素降解酶时添加底物木屑和2，6-DMP后，MnP最大酶活为8.06U/L，漆酶最大酶活为9. 85U/L，但不产生LiP。在毛竹篼降解过程中，三种酶活都能检测到，说明自然降解过程中有多种微生物参与，漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶能共同作用降解毛竹篼。

3 结论与讨论

（1）在不同腐烂程度的毛竹篼中，灰分与腐烂等级存在极显著正相关，综纤维素与腐烂等级存在显著负相关，综纤维素与灰分、1%NaOH抽出物接近显著负相关，酸不溶木质素与腐烂等级接近显著负相关，酸不溶木质素与灰分存在极显著负相关。棉花酶活与滤纸酶活存在极显著正相关；CMC酶活与滤纸酶活存在极显著正相关，CMC酶活与棉花酶活接近显著正相关。漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶三种木质素酶活都能检测到。降解过程中成分含量变化呈现一定的规律和相关性，并含有多样、丰富的纤维素酶和木质素酶，酶活也呈现出一定的规律性和相关性。

（2）纤维素酶和木质素酶在前期时，微生物数量不高，毛竹壁的紧密结构又较难侵入，所以酶活都比较低；在中期物质丰富的时候，微生物大量繁殖、生长，酶活偏高；后期随着物质的不断降解，可利用的物质不多，微生物受到抑制甚至死亡，导致酶活处于较低水平。

（3）毛竹篼自然降解过程中含有丰富的酶类物质，这是多种微生物分泌的结果。因此，将自然腐烂毛竹篼中的降解菌富集培养后再用于新砍伐后毛竹篼的降解；或者从自然毛竹篼中提取高效降解微生物，通过富集培养用于新砍伐后毛竹篼的降解，具有一定的研究价值和实际意义。

[1]丁新新, 洪 伟, 陈建忠, 等. 不同经营模式下毛竹林土壤水分物理性质比较[J]. 水土保持研究, 2009, 16(3): 74-78.

[2]徐 明, 任海青, 徐金梅, 等. 中国近五年竹材加工利用研究进展及展望[J]. 世界林业研究, 2008, 21(1): 61-67.

[3]陈玉和, 陈章敏, 吴再兴, 等. 竹材人造板生产技术[J]. 竹子研究汇刊, 2008, 27(2): 5-10.

[4]徐有明, 郝培应, 刘清平. 竹材性质及其资源开发利用的研究进展[J]. 东北林业大学学报, 2003, 31(5): 71-77.

[5]刘婧婧. 竹林伐后竹篼清理技术与设备研究[D]. 北京: 中国林业科学研究院, 2011.

[6]李慧蓉. 白腐真菌生物学和生物技术：第2版[M]. 北京: 化学工业出版社, 2005.

[7]陈素华. 白腐真菌的木质素降解酶[J]. 生物学通报, 2005,40(8): 26-27．

[8]段传人, 朱丽平, 姚月良. 三种白腐菌及其组合菌种木质素降解酶比较研究[J]. 菌物学报, 2009, 28(4): 577-583.

[9]李 超. 竹伐桩促腐微生物的筛选及培养条件的研究[D]. 河北: 河北大学, 2008.

[10]池玉杰, 闫洪波. 红平菇木质素降解酶系统漆酶、锰过氧化物酶及木质素过氧化物酶的检测[J]. 林业科学, 2009, 45(12):154-158.

[11]董晓娜.竹材木质素降解菌营养调控及产酶影响因子研究[D].长沙:中南林业科技大学,2010.

[12]Wariishi H, Valli K, Gold M H. Manganese II oxidation by manganese peroxidase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium-kinetic mechanism and role of chelators[J].Journal of Biological Chemistry, 1992, 267(33): 23688-23695.

[13]Eggert C, Temp U, Eriksson K E. The ligninolytic system of the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus: puri fi cation and characterization of the laccase[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62:1151-1158.

[14]Tien M, Kirk T K. Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium[J]. Methods in Enzymology, 1988,161: 238-249.

[15]李与文, 王慧丽. 制浆造纸分析检验[M]. 北京: 化学工业出版社, 2004.

[16]郝 月, 杨翔华, 张 晶, 等. 秸秆纤维素分解菌的分离筛选[J].中国农学通报, 2005, 21(7): 58-60.

[17]马怀良, 郭文学, 柴军红. 常温高效纤维素分解菌的筛选[J].东北农业大学学报, 2010, 41(1): 52-55.

[18]尹立伟, 池玉杰, 王雪童. 灰树花的系统发育分析和主要木质素降解酶的测定[J]. 林业科学研究, 2010, 23(4): 574-580.

Research on ingredient and enzyme activity of the bamboo stump on different decomposition degree

LI Mei-qun, AI Wen-sheng, MENG Yong, YANG Ming, TU Jia, PU Xiang-yun, LIU Xiang-bo
(Hunan Forestry Academy, Changsha 410004, Hunan, China)

The analysis of composition and enzyme activity of the bamboo stump on different decomposition degree, results showed that each ingredient and enzyme activity present certain regularity and correlation in the degradation process. During the process of degradation,ash,hot water extract, 1%NaOH extract, cellulose,cellulose, acid-insoluble lignin high values was 32.39%, 14.03%,48.13%, 41.45%, 50.67%; minimum values was 3.32%, 5.44%, 27.7%, 24.67%, 25.15%. Filter paper enzyme activity and CMC enzyme activity and cotton cellulose enzyme supreme values was 116.79×103U/kg, 155.90×103U/kg, 76.66×103U/kg. Laccase, manganese peroxidase and lignin peroxidase enzyme activity maximum values was 18.15×103U/kg, 9.60×103U/kg, 0.32×103U/kg. Earlier and later stage enzyme activity was low, when medium-term ingredient rich, microbial growth, reproduction, enzyme activity was high.

bamboo stump; cellulase; laccase; manganese peroxidase; lignin peroxidase

S795.7

A

1673-923X(2016)04-0035-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.04.007

http: //qks.csuft.edu.cn

2015-01-04

湖南省林业科学院青年创新基金（2013LQJ09）；高品质毛竹笋高效培育技术示范推广（[2013]XT05）

李美群，硕士研究生，助理研究员

艾文胜，研究员；E-mail：aiwensheng@163.com

李美群，艾文胜，孟 勇，等. 不同腐烂程度毛竹篼成分及酶活研究[J].中南林业科技大学学报，2016, 36(4): 35-40.

[本文编校：吴 彬]