顺铂处理后几种hTERT mRNA剪接异构体的变化*

杨梦莉， 陈香岭， 隋 旭， 廉亚茹， 马春霞， 姚宇峰， 史 荔， 马千里, 俞建昆**

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 医学生物学研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明理工大学， 云南 昆明 650093; 3.昆明医学大学第三附属医院 胸外科， 云南 昆明 650118)



顺铂处理后几种hTERTmRNA剪接异构体的变化*

杨梦莉1， 陈香岭1， 隋 旭2， 廉亚茹1， 马春霞1， 姚宇峰1， 史 荔1， 马千里3, 俞建昆1**

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 医学生物学研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明理工大学， 云南 昆明 650093; 3.昆明医学大学第三附属医院 胸外科， 云南 昆明 650118)

目的： 利用顺铂处理肺癌、宫颈癌细胞和人胚肾细胞，检测人类端粒酶逆转录酶催化亚单位(hTERT)mRNA的选择性剪接是否发生变化。方法:将培养的肺癌A549和H1299细胞，宫颈癌C33A、SiHa和CaSki细胞及人胚肾293FT细胞分为实验组和对照组，用顺铂处理实验组细胞，DMSO处理对照组细胞；设计hTERT α+β+、α+β-、α-β+、INS3及DEL[e2]引物，提取两组细胞的总RNA，利用RT-PCR检测hTERTmRNA 剪接异构体表达。结果:与对照组细胞相比，随着顺铂浓度的增加，肺癌A549和H1299细胞，宫颈癌C33A、SiHa和CaSki细胞以及人胚肾293FT细胞中hTERTα+β- 和INS3异构体比例升高，而DEL[e2]异构体变化不明显。结论:在顺铂引起的DNA损伤情况下，细胞可利用hTERTmRNA选择性剪接调控机制进行调节，通过改变不同异构体的量和所占比例，从而调节端粒酶功能活性。

肺肿瘤； 宫颈肿瘤； 人胚肾细胞； 细胞，培养的； 人类端粒酶逆转录酶催化亚单位； 顺铂

端粒是真核细胞线性染色体的末端物质，由TTAGGG重复序列构成，端粒DNA序列具有高度保守性，在维持染色体稳定性中起重要作用。人端粒酶主要由两个亚单位组成，即端粒酶RNA(hTR)和催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)[1]。hTERT作为端粒酶的限速酶，在端粒酶的活性调节中起关键作用。研究表明，端粒酶活性的调节主要依赖于hTERTmRNA的表达，而hTERTmRNA表达会由于选择性剪接(alternative splicing)而产生多个异构体，到目前为止已发现14种hTERT 转录异构体，主要是由于外显子的缺失及内含子的插入造成的[2-3]。Pre-mRNA选择性剪接作用可以调节hTERT基因的表达量，同时也可以改变蛋白的结构，对端粒酶活性产生重要的影响[4]。近来研究表明，用DNA损伤试剂或者辐射处理细胞后，一些与细胞周期和凋亡相关的基因会相应的发生选择性剪接的变化[5]。抗癌药物顺铂具有诱导细胞凋亡作用，可引起DNA链断裂，本研究选取肺癌A549、H1299细胞，宫颈癌C33A、SiHa和CaSki细胞及人胚肾293FT细胞用顺铂处理，探究hTERT的α+β+、α+β-、α-β+、INS3及DEL[e2]几种剪接异构体是否发生改变，并且这些异构体所占比例在顺铂不同浓度处理样品中是如何变化的，为探讨端粒酶不同剪接异构体的功能及其调控剪接信号通路和机制提供信息，为临床治疗肿瘤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与分组

细胞NCI-H1299、C33A、SiHa、CaSki及293FT购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，A549购自中国科学院昆明动物所细胞中心。NCI-H1299细胞使用Hyclone改良型RPMI-1640培养基，其余细胞均使用Hyclone DMEM/HIGH GLUCOSE培养液(GE Healthcare Life Sciences)，两种培养液均含10%FBS(Certified Foetal Serum, Biological Industries)，青霉素和链霉素浓度分别为100 U/mL和100 mg/L,培养条件为37 ℃、5%的CO2。顺铂购自Sigma Aldrich公司，用DMSO溶解后使用。顺铂加入时细胞处于对数增长期，在培养皿表面覆盖率为70%～90%。5种肿瘤细胞都分为实验组和对照组，实验组细胞用不同浓度的顺铂处理，对照组细胞用相应浓度的DMSO处理；对照组中A549、H1299、C33A、SiHa、CaSki、293FT细胞加入DMSO浓度分别为56、72、63、56、42、63 μmol/L。实验组中A549、H1299顺铂浓度分别是7、14、21、28、35、42、49、56 μmol/L和9、18、27、36、45、54、63、72 μmol/L，C33A浓度为 9、18、27、36、45、54、63 μmol/L,SiHa浓度为8、16、24、32、40、48、56 μmol/L,CaSki浓度为6、18、24、30、36、42 μmol/L，293FT浓度为9、18、27、36、45、54、63 μmol/L。

1.2 提取总RNA

各组细胞在顺铂或DMSO处理24 h时倾倒除去培养液，用预冷的PBS冲洗1次，彻底除去PBS后，加入RNAiso Plus(TakaRa公司)，按照试剂说明书程序提取总RNA。

1.3 检测异构体

oligo(dT)18引物用PrimeScript Ⅱ逆转录酶(TaKaRa公司)进行逆转录反应得到cDNA第一链，再用PCR引物进行PCR扩增检测。α+β-和α-β+ 上游引物为5′-GCCTGAGCTGTACTTTGTCAAG -3′,下游引物为5′-GCAAACAGCTTGTTCTCCATGTC-3′。引物设计起始于外显子5和终止于外显子9，产物大小为274、456 bp；INS3上游引物为5′-CTCCATCCTGAAAGCCAAGAAC-3′,下游引物为5′-TGTCGAGTCAGCTTGAGCAG-3′,引物设计起始于外显子14和终止于外显子15，产物大小为123、282 bp；DEL[e2]上游引物ACTACCGCGAGGTGCTGC，下游引物GACGACGTACACACTCATCAG，引物设计起始于外显子1和终止于外显子3，产物大小259、1613 bp，如图1所示。PCR反应总体积20 μL，94 ℃ 3 min预变性；94 ℃ 变性30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，35次循环，72 ℃延伸5 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 数据分析

利用RT-PCR进行试验检测，实验所得数据用Bio-RAD凝胶成像仪自带分析软件处理，最终数值为3次实验结果平均值。

注：全长α+β+剪接异构体包含16个外显子和完整的RT结构域，α-β+剪接异构体位于第6外显子处缺失36个核

2 结果

2.1hTERTα+β- mRNA异构体的变化

与对照组细胞比较，实验组A549、H1299、293FT、C33A、SiHa及CaSki细胞随着顺铂浓度的增加，α+β+异构体(*a)的比例呈先增加、后逐渐降低的趋势，而α+β-异构体(*b)的比例逐渐增加，其中293FT、CaSki以及C33A细胞中出现36 bp的α-β+(*c)目标带，变化趋势与α+β+异构体一致。如图2。

2.2hTERTINS3 mRNA异构体的变化

与对照细胞相比，在实验组A549、 H1299、293FT、C33A和SiHa细胞随着顺铂浓度的增加，α+β+(*b)异构体的比例呈逐渐降低的趋势，而INS3异构体(*a)的比例逐渐增加。如图3。

2.3hTERTDEL[e2] mRNA异构体的变化

实验组A549、SiHa、H1299细胞中，α+β+异构体(*a)和异构体DEL[e2](*b)与对照细胞相比，变化趋势不明显。在C33A细胞中，α+β+异构体(*a)变化趋势不明显，因DEL[e2]异构体缺失少，导致DEL[e2](*b)未出现目标条带。

3 讨论

hTERT是端粒酶功能的限速酶，端粒酶的活性是由hTERT在转录水平调控的，hTERT的转录存在着选择性剪接的现象。已有研究表明，过表达α+β+异构体和α+β-异构体都有保护细胞在顺铂处理情况抗凋亡的作用，因α+β-异构体RT 功能结构域的缺失，导致其没有端粒酶活性[6]。本文研究结果显示，α+β-异构体在顺铂处理时，随着顺铂浓度增加而所占比例逐渐增高，可能原因是在顺铂造成DNA 损伤时，细胞生长分裂受抑制，高表达的α+β-转录水平导致端粒酶处于低活性状态，有利于细胞阻滞于G2期检查点进行DNA损伤修复。此外，Shusen Zhu等[7]人报道了INS3异构体可抑制端粒酶活性，细胞生长变缓，具有负调控功能。本实验结果显示INS3异构体随着顺铂浓度增加，比例逐渐增加，由此可以推测在顺铂处理作用下，INS3异构体因RT结构域的不完整导致端粒酶活性逐渐降低，但INS3异构体是否也具有抗凋亡作用还需进一步探究。hTERT DEL[e2]在顺铂处理下，无明显变化，但目前DEL[e2]异构体与端粒酶活性的相关性还未曾报道，是进一步需要研究的问题。几种剪接异构体的变化说明在应对顺铂引起的DNA损伤中，hTERTmRNA剪接异构体的水平和比例的变化是引起端粒酶功能活性降低的一种调节方式。

注：*a表示α+β+异构体，*b表示α-β+异构体，*c表示α+β-异构体;-A表示α+β+异构体剪接百分比；

注：*a表示α+β+异构体，*b表示α-β+异构体，*c表示α+β-异构体;-A表示α+β+异构体剪接百分比；

注：*a表示α+β+异构体，*b表示α-β+异构体，*c表示α+β-异构体;-A表示α+β+异构体剪接百分比；

近年来研究发现 NF-κB 信号通路的激活与 hTERT 的表达和端粒酶活性有关。利用 NF-κB抑制剂姜黄素抑制神经母细胞瘤细胞的 NF-κB 信号通路，可以明显的抑制端粒酶活性，hTERTmRNA和蛋白表达[8]。Sykorova等[9]实验进一步说明 NF-κB 可以通过对hTERT启动子的增强调节而调节 hTERT 的表达。此外，DEL[e4-13]异构体通过剪接调控能够在端粒酶阳性和阴性细胞中增强Wnt信号[10],但是在顺铂造成的DNA损伤情况下，α+β-的活性是否与Wnt 信号通路有关，NF-κB 信号通路的激活与 hTERT 的表达和端粒酶活性影响还未有人报道，以上已证实的研究结果将为本试验进一步研究在顺铂造成细胞DNA损伤情况下，探究引起hTERT剪接变化的信号通路奠定基础。

目前已报道在DNA损伤情况下，TERT会从核内转位至线粒体，在线粒体中的TERT 能够降低线粒体中活性氧ROS(reactive oxygen species)水平，减轻线粒体DNA(mtDNA)损伤，通过增强线粒体功能从而提高细胞应对DNA损伤能力使细胞呈现抗凋亡的效应[11]，且α+β+和α+β-异构体在顺铂处理下都具有抗凋亡的作用[6]，过表达α+β+异构体可提高基因组稳定性和DNA修复[12]。本实验结果显示随着顺铂浓度增加，α+β-异构体比例增加，文献已报道α+β+和α+β-异构体都能定位于线粒体，推测α+β-与α+β+异构体可能具有帮助或协同DNA修复功能，即在线粒体中通过增加顺铂诱导的DNA损伤修复从而对细胞进行凋亡保护，但这一问题还需进一步证实。而对于INS3和DEL[e2]异构体在顺铂处理下，hTERT是否会从核转移至线粒体，能否减轻线粒体DNA损伤，异构体的变化是否与凋亡耐受有关，这些问题还未曾报道，因此这些异构体是否能转移到线粒体中发挥相应的功能有待研究，线粒体转移定位以及凋亡的变化将成为下一步探究目标。在顺铂处理下异构体比例的变化可能是一种应对外界刺激细胞耐受相适应的现象，以适应细胞维持基因组稳定的生理功能需要。

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(2016-07-20收稿，2016-10-12修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 赵 毅

Several Splice Isoforms of hTERT mRNA and Its Change in Cells after Treatment with Cisplatin

YANG Mengli1, CHEN Xiangling1, SUI Xu2, LIAN Yaru1, MA Chunxia1,YAO Yufeng1, SHI Li1, MA Qianli3, YU Jiankun1

(1.InstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Kunming650118,Yunnan,China; 2.KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650093,Yunann,China; 3.DepartmentofThoracicSurgery,theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650118,Yunnan,China)

Objective: To determine whether there is any change of alternative splicing of hTERT mRNA in lung cancer and cervical cancer cells and human embryonic kidney cells after cisplatin treatment, different dose of cisplatin were used to treat these two types of cell line. Methods: Cultivated lung cancer A549 and H1299 cells, cervical cancer C33A, SiH aand CaSki cells and HEK 293FT cells were divided into experiment group and control group; using cisplatin to treat experiment group cells and DMSO to treat control group cells; hTERT α+β+，α+β-，α-β+，INS3，DEL〗 alternative splicing sites were selected to design primers. Total RNA of treated cells and control cells after treatment with cisplatin were extracted and RT-PCR was used to test the spliced transcripts, and their ratios of hTERT mRNA in cancer cells. Results: The results indicated that the ratio of the hTERT α+β- and INS3 isoform increased with the increase of the concentration of cisplatin; but the change of DEL 〗 was not obvious. Conclusion: The activity of telomerase may be regulated through the expression and ratio of different alternative splicing isoforms of hTERT when DNA impairment.

lung neoplasm; cervical neoplasm; human embryonic kidney cells; cell,cultured; human telomerase reverse transcriptase; cisplatin

中国医学科学院病原生物学研究所基本科研业务费项目(2012IPB107)； 高等学校博士学科点专项科研基金(新教师类)(20111106120056)

�� E-mail:yjk@imbcams.com.cn

时间：2016-11-15 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.018.html

R512.6

A

1000-2707(2016)11-1279-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.009