利用顶空固相微萃取、液液萃取和香气分馏技术鉴定糠壳的挥发性成分

赵 东，郑 佳，彭志云，杨康卓，张建敏，吕学兰，杨 蓉

（五粮液集团技术研究中心，四川宜宾644007）

利用顶空固相微萃取、液液萃取和香气分馏技术鉴定糠壳的挥发性成分

赵 东，郑 佳，彭志云，杨康卓，张建敏，吕学兰，杨 蓉

（五粮液集团技术研究中心，四川宜宾644007）

基于实际生产用酒甑，清蒸酿酒用糠壳，获得了糠壳清蒸馏出液。利用顶空固相微萃取、液液萃取、香气分馏技术研究了糠壳清蒸馏出液的挥发性成分。研究结果表明，共鉴定出180种挥发性成分，其中，包括醛类28种、酮类38种、芳香族36种、醇类21种、呋喃类12种、萜烯类12种、内酯及呋喃酮类9种、酯类3种、吡嗪类6种、硫化物4种、杂环类5种、烃类6种。本实验研究多种风味化学前处理技术定性糠壳的挥发性组分，涵盖了赋予青草味的直链饱和醛类、甜香味的酮类、坚果焙烤味的吡嗪类、米饭特征香气的不饱和醛类化合物、潜在助香作用的呋喃酮和内酯化合物以及具有邪杂味的硫化物和土味素等，对白酒酒质的控制提供了理论依据。

糠壳； 挥发性成分； 鉴定； 顶空固相微萃取； 液液萃取； 分馏

糠壳作为生产浓香型白酒的主要辅料，在白酒酿造过程中扮演着举足轻重的角色。它不仅为酒醅发酵中微生物群落的代谢演替提供了疏松的空间，而且为酒醅蒸馏中挥发性成分的馏出提供了膨松的传质空间。由于糠壳中含有大量的糠味、苦味物质，实际生产过程中蒸糠的目的主要是为了去除糠壳的邪杂味[1]。同时，生产过程中糠壳的用量较大，占原料的17%～26%。可见，糠壳显著影响了白酒蒸馏过程中原酒酒体风格的形成。

实际生产中要求：熟糠配料，糠壳既要有“糠香”又要有“骨力”。但是目前糠壳在蒸馏前后香气特征的变化仅仅凭借生产人员的感官判定，这种操作极其容易造成蒸糠过程质量控制的主观性。近年来，现代风味化学技术已经广泛应用于白酒及相关的原辅料、糟醅等挥发性成分的定性、定量研究。江南大学徐岩、范文来教授课题组基于搅拌棒吸附萃取（SBSE）、顶空固相微萃取（HS-SPME）、液液萃取（LLE）、正相色谱分馏技术（fractionation）等构建了我国大部分蒸馏酒的挥发性成分数据库[2-4]，极大程度上促进了对白酒的认知程度的提高。然而由于种种原因，对实际生产中糠壳中挥发性成分的全面性认识还十分缺乏，糠壳对白酒酒质的影响程度更无从知晓。因此，弄清糠壳中挥发性成分的构成信息以及糠壳对白酒酒体风格的贡献作用，对科学控制白酒酒质有着积极的作用。

本研究基于实际生产规模水平，获得了糠壳清蒸馏出液，综合多种风味化学前处理技术优势，包括HSSPME、LLE和fractionation技术，有效提取了糠壳清蒸馏出液中的挥发性成分，结合质谱匹配度、保留指数和标准品进行成分的定性，获得较为全面的糠壳挥发性成分数据库，以期为探讨糠壳对酒质的影响提供数据支撑，为实际生产提供理论指导依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 样品采集

称取250 kg生糠壳倒入酿酒用甑桶（约2m3）中，底锅中注入清水，控制蒸汽压力恒定为0.04MPa，待蒸汽穿透糠壳料层后，关闭甑桶上盖（盖盘），收集糠壳清蒸馏出液，蒸馏总时间为50m in，合并所有馏出液，取综合样品进行挥发性成分的提取与鉴定。

1.1.2 试剂和仪器

无水乙醚、正戊烷、二氯甲烷（CH2Cl2）均为分析纯，使用之前均进行重蒸。无水Na2SO4、NaCl为ACS级。超纯硅胶（60～200μm，60Å）购自Alfa Aesa公司。C7—C30直链正构烷烃、乙偶姻购自美国Sigma-Aldrich公司。乙醛、2-戊酮、异戊醇、正己醇、3-甲基丁醛、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、糠醛、苯乙醇、4-乙烯基愈创木酚等购自TCI（上海）公司。

顶空固相微萃取手柄和50μm CAR/DVB/PDMS纤维萃取头购自美国Supelco公司。气质联用仪为6890N-5973MSD购自美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HS-SPME

吸取3m L馏出液于20m L顶空样品瓶中，加入Na-Cl饱和及特氟龙磁力搅拌子（转速500 r/m in），置于50℃水浴中平衡15m in，插入萃取头吸附45m in，随后插入GC进样口热解析5m in，分析其中挥发性成分。

1.2.2 LLE

取100m L馏出液于分液漏斗中，加NaCl饱和。再加入30m L重蒸CH2Cl2，振荡萃取10m in；重复以上步骤2次，合并CH2Cl2萃取物，无水Na2SO4干燥萃取物，自然条件下浓缩至1m L，待测。

1.2.3 Fractionation

取100m L馏出液于分液漏斗中，加NaCl饱和。再加入30m L重蒸无水乙醚，振荡萃取10m in；重复以上步骤2次，合并萃取物，适量无水Na2SO4干燥萃取物，自然条件下浓缩至0.5m L，进行硅胶正相色谱分馏，分馏方法见参考文献[5]。

1.3 GC-MS条件

利用配备了极性色谱柱DB-WAX（30.0m×0.25mm× 0.25μm）的GC-MS分析样品中的挥发性成分。

气相色谱条件：进样口温度250℃，载气(He)流速1m L/m in，其中，HS-SPME采用不分流模式进样，LLE采用分流模式，分流比为2∶1；气相色谱升温程序为：起始柱温40℃，保持5m in，以4℃/m in升至230℃，保持15m in。

质谱条件为：质谱EI源，电子轰击能量70 eV；离子源温度200℃，四级杆温度150℃，质量数扫描范围35～350 amu。

1.4 化合物鉴定

挥发性成分的鉴定采用以下策略：首先将化合物的质谱图与NIST08标准数据库（美国Agilent公司化学工作站内置）中的标准图谱进行比对，匹配度＞800（最大值1000），作为初步定性结果（MS）。再计算各化合物的Kováts保留指数（RI），并与文献报道的保留指数值（RIL，均为DB-WAX色谱柱计算值）进行比较。同时，与标准品的香气特征以及在相同色谱条件下的保留时间对比（Std），最终确定该化合物的归属。其中，RI计算方法参考文献[6]所述。

2 结果与分析

2.1 LLE和HS-SPME的总离子流图

浓香型白酒生产过程中，生糠壳中含有大量的霉味、糠臭味等，如若清蒸不当，则这些物质将会随白酒的蒸馏过程进入原酒中，进而影响原酒酒体风格特征。由于生产中糠壳的清蒸采用酒甑敞口清蒸操作，为了获得较为真实的实际生产水平中糠壳挥发性成分的组成信息，本研究中采用了酒甑盖盘蒸馏的方式，收集蒸馏50min的清蒸馏出液，取混合均匀的综合样品进行挥发性成分的提取与分析。

分别利用HS-SPME、LLE和fractionation等方法获得了糠壳清蒸馏出液中挥发性成分的浓缩样品。经GC-MS分析（图1），根据质谱匹配度、RIL的比对结果共鉴定出180种挥发性成分，包括醛类28种、酮类38种、芳香族36种、醇类21种、呋喃类12种、萜烯类12种、内酯及呋喃酮类9种、酯类3种、吡嗪类6种、硫化物4种、杂环类5种、烃类6种。

2.2 醛类

表1所示，共检出了醛类化合物28种，其中不饱和醛种类最多，为16种，其次为直链饱和醛（8种）和支链饱和醛（4种）。

不饱和醛包括2-丙烯醛、2-甲基丙烯醛、巴豆醛、3-甲基-2-丁烯醛、(E)-2-庚烯醛、2-乙基-2-己烯醛、(Z)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-己二烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2, 4-辛二烯醛、(E)-2-壬烯醛、顺-2-癸烯醛、(E,Z)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,Z)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛。其中有6种在浓香型白酒中检出（表1）。过去研究中经同时蒸馏萃取提取仅仅检出了部分不饱和醛，如2-庚烯醛、2-癸烯醛、2-辛烯醛[7-8]；而其余大部分的不饱和醛则是第一次在酿酒用糠壳中检测到。

图1 LLE和HS-SPME的总离子流图

直链饱和醛包括乙醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、2-十二醛。其中有5种在过去糠壳的同时蒸馏提取物中被检出[8]，由于本研究采用了多种样品前处理方法，基于溶剂提取进样分析中处于质谱中溶剂延迟时间内的己醛和戊醛在本研究中被HS-SPME检出。此外，浓香型白酒中也全部检出了这些直链饱和醛。

支链饱和醛包括2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、3,3-二甲基己醛、5-甲基己醛。2-甲基丁醛和3-甲基丁醛是白酒常见的支链饱和醛类，而3,3-二甲基己醛和5-甲基己醛则是第一次在糠壳中检出。

直链醛类化合物中己醛、辛醛、壬醛、癸醛和不饱和醛中(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛等已被确认是米饭的香气活跃化合物[9]。己醛、戊醛等呈强烈的青草味，辛醛具有柑橘香气，香气阈值分别为5 ppb、3 ppb和3 ppb。不饱和醛中E-2-辛烯醛、(E, E)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛等呈油脂和青草的复合香气，香气阈值则十分低，仅为0.09 ppb[10]。由此可见，生糠壳中含有大量的呈青草味、花香味、油脂味等复杂气味的化合物，蒸糠过程对香气成分的蒸馏效果将直接影响熟糠壳的香气特征。

2.3 酮类

表1 糠壳清蒸液中醛类化合物

由表2可知，共检出酮类化合物38种，其中饱和酮数量最多（17种），其次为不饱和酮（9种）、环酮（10种）、羟基酮（1种）和二酮（1种）。

本研究中，饱和酮中2-戊酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮、2-癸酮、2-十一烷酮和不饱和酮中3-戊烯-2-酮、1-辛烯-3-酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-羟基-2-丁酮、3-乙基环戊酮、3,5,5-三甲基-2-环戊烯-1-酮在浓香型白酒中均有检出。

除1-辛烯-3-酮呈显著的蘑菇味和土腥味[11]（香气阈值1 ppb）外，绝大部分的酮类化合物均呈现出花香味和水果味等甜香味，如米饭中活跃香气化合物3-辛烯-2-酮呈玫瑰花味、2-壬酮呈水果味和奶酪味，2-癸酮呈水果味、油脂味和葡萄汁味。值得注意的是本研究中检出了相当多数量的环酮类化合物，并且进行了定性，而对这类化合物对糠壳乃至我国浓香型白酒香气的贡献度的认识还不清楚，值得进一步深入探讨。

2.4 醇类

由表3可知，共检出醇类化合物21种，其中支链醇6种、直链醇5种，不饱和醇4种、多元醇2种、二醇2种、环状醇2种。11种醇类在浓香型白酒中有检出，异戊醇是浓香型白酒中的杂醇油。1-辛烯-3-醇具有强烈的蘑菇味和土腥味，阈值为2.7 ppb，其在米糠中也被检出[8]。米饭中检出的戊醇、辛醇和壬醇具有甜味、蜡味和柑橘味等，阈值为17.8～156 ppb，而香气活跃指数均小于0.01，是米饭中对香气贡献较弱的成分[9]。

2.5 芳香族

本研究中检出芳香族化合物36种（表4），目前研究结果确认的白酒中具有典型香气的化合物包括苯乙醛、愈创木酚、β-苯乙醇、4-乙烯基愈创木酚、萘、香草醛等[12]。在米糠中检出的芳香族化合物包括苯乙醛、4-乙烯基愈创木酚、愈创木酚和香草醛[8]。米饭中同时也检出了4-乙烯基愈创木酚、萘、愈创木酚[12-13]。在这些化合物中，苯乙醇呈强烈的玫瑰花香（香气阈值19.6 ppb）[14]，愈创木酚呈甜味和墨水气味，香草醛呈强烈的香草味和甜味，4-乙烯基愈创木酚呈强烈的烟熏味和木材味，萘呈强烈的樟脑味，土臭素具有典型的土腥味[15]。由此可见，芳香族类化合物中既有米饭香气的助香剂，又有诸如樟脑味、土腥味等邪杂味化合物，对蒸糠过程的跟踪调查结果将进一步揭示蒸糠对糠壳香气的影响程度（另文发表）。

表2 糠壳清蒸液中酮类化合物

表3 糠壳清蒸液中醇类化合物

表4 糠壳清蒸液中芳香族化合物

此外，本研究中检出了多种芳香烃，包括间二甲苯、邻二甲苯、1,3,5-三甲基苯、1,2,3,4-四甲基苯等，且这类化合物部分在过去浓香型白酒香气成分的研究中已经被检出[2]，表明糠壳中含有的香气化合物可能是白酒的香气来源之一。

2.6 呋喃

共检出了11种呋喃类物质（表5）。有研究认为呋喃类化合物的香气阈值较高，对白酒香气的影响不显著[2]。糠醛是糠壳受热产生的特征产物之一，具有苦杏仁气味，并且是白酒中主要的苦味物质之一。

2.7 萜烯

大量萜烯类化合物常常在葡萄酒中被检出[16]，江南大学徐岩教授课题组在我国白酒中也检出这类化合物[2]。本研究共检出萜烯类11种（表6），其中β-大马酮、伞花烃、芳樟醇、芳樟醇氧化物、α-松油醇、β-紫罗酮、γ-紫罗酮、丁香酚等均在我国白酒中有检出，且对白酒的贡献度正在深入的研究中。以β-大马酮为例，该化合物在葡萄酒中广泛存在，由于其香气阈值极低（0.002 ppb），且对焦糖香气、烟草等复合香味，对酒类香气有烘托作用，故其被列为葡萄酒风味化学领域的研究热点。由此可见，与葡萄等相比，糠壳也属天然产物，糠壳中理应存在这类萜烯化合物。

2.8 内酯及呋喃酮

我国浓香型白酒中已检出了9种内酯及呋喃酮类化合物，这类化合物由于阈值特别低，且呈果香味、甜香味等香气特征。本研究中检出了6种内酯（表7），并且均在白酒中被检出，这说明糠壳也是白酒中内酯的来源之一。同时，也检出了4种呋喃酮，如2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮，又名芒果呋喃酮，具有强烈的焦糖味。在葡萄酒的研究中，呋喃酮类化合物呈显著的焦糖味、水果香和甜香味等，对酒类香气具有显著的增强作用[17-18]，并且在大米、糯米的蒸煮过程中也产生了一些呋喃酮[19]。但是检出的呋喃酮类物质在糠壳中是否存在显著的米香味还需闻香确定。

2.9 酯类

检出的酯类化合物主要是长链脂肪酸的衍生物（表8），过去的研究中糠壳中主要的脂肪酸类化合物是油酸C18∶1和亚油酸C18∶2，百分比分别为41.21%和27.53%[20]。

2.10 吡嗪

由表7可知，共检出了6种吡嗪类化合物，除哌嗪在白酒中没有检出，其余各种吡嗪均在浓香型白酒中检出。吡嗪类化合物均呈强烈的烘焙味、坚果味和巧克力味等。本研究检出的吡嗪类可能与糠壳中氨基酸受热发生美拉德反应有关。

2.11 硫化物

硫化物在白酒和葡萄酒中常常被认为是异嗅味化合物，含量越高对酒体的影响程度越明显。本研究中二甲基三硫（表8）在白酒中有检出，其香气阈值极低（0.005～0.01 ppb），呈强烈的烂白菜叶、洋葱味[21]。

表5 糠壳清蒸液中呋喃化合物

表6 糠壳清蒸液中萜烯类化合物

表7 糠壳清蒸液中呋喃酮及内酯化合物

表8 糠壳清蒸液中酯类及吡嗪类化合物

表9 糠壳清蒸液中杂环及烃化合物

2.12 杂环及烃类化合物

本研究中检出了5种杂环类和5烃类化合物（表9），其中2-乙酰吡咯具有典型的面包、核桃气味，但气味阈值较高（170 ppm）。

3 结论

酿酒生产证明，糠壳是我国浓香型白酒生产不可或缺的填料，通过使用糠壳可保证蒸馏和发酵的正常进行。酿酒工艺规定中熟糠配料的目的就是去除生糠壳中含有大量的霉味、糠臭味等不愉快气味。若清蒸不当，这类物质会大大影响原酒酒体风格特征。本研究中，检出了具有青草味的直链饱和醛类以及具有邪杂味的硫化物和土臭素等赋予糠壳邪杂味的挥发性化合物；同时，也检出了具有甜香味的酮类、坚果焙烤味的吡嗪类、米饭特征香气的不饱和醛类化合物、潜在助香作用的呋喃酮和内酯化合物等物质，这些物质或许对白酒香气有一定的贡献。由于对糠壳中活跃香气化合物（odor-active compounds）构成以及对原酒香气的贡献度缺乏认识，目前，我们正在开展各种化合物对糠壳香气贡献度的确认工作以及蒸糠过程中香气活跃化合物的变化情况等。

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Identification of Volatile Compounds in Rice Husk by Head-Space Solid-Phase M icroextraction,Liquid-Liquid Extraction and Flavor Fractionation

ZHAO Dong,ZHENG Jia,PENG Zhiyun,YANG Kangzhuo,ZHANG Jianm in,LV Xuelan and YANGRong
(TechnicalResearch Center,Wuliangye Group Co.Ltd.,Yibin,Sichuan 644000,China)

In this study,rice husk was steamed and the volatile compounds in the distillatewere identified by HS-SPME,LLE and flavor fractionation.The results showed that,a total of 180 volatile compoundswere identified including 28 aldehydes,38 ketones,36 aromatic compounds,21 alcohols,12 furans,12 terpinenes,9 lactones and furanones,3 esters,6 pyrazines,4 sulfur compounds,5 heterocyclic compounds and 6 alkanes.A lotof compoundswere reported firstly by usingmultiple flavor pretreatmentmethods including aldehydesw ith grassy odor, ketonesw ith sweet odor,pyrazinesw ith nutty odor,unsaturated aldehydesw ith rice odor,aroma-enhancers,and off-flavor compounds.This studymay provide theoreticalevidence forquality controlof liquor.

rice husk;volatile compounds;identification;HS-SPME;LLE;fractionation

TS262.3；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286（2016）12-0031-09

10.13746/j.njkj.2016258

固态发酵资源利用四川省重点实验室开放基金（2015GTY005）。

2016-08-25

赵东（1964-），男，教授级高工，硕士生导师，中国酿酒大师，主持省部级课题多项，发表学术论文数十篇。

郑佳（1986-），男，博士后研究员，研究方向：酒类风味化学与微生物。

优先数字出版时间：2016-11-21；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161121.1645.007.htm l。