水体浮游植物叶绿素a浓度测定方法比较

程春梅，黄伟朵，张 伟

(浙江水利水电学院 测绘与市政工程学院，杭州 310018)

水体浮游植物叶绿素a浓度测定方法比较

程春梅，黄伟朵，张 伟

(浙江水利水电学院 测绘与市政工程学院，杭州 310018)

叶绿素a是反映水体中浮游植物生物量的重要指标，其含量的准确测定具有十分重要的意义.以实验室培养的铜绿微囊藻为例，比较了常用的四种提取方法和三种测量方法对叶绿素a浓度测量结果的影响.实验结果表明：使用热丙酮法提取叶绿素a浓度效率最高；不同测量方法得到的叶绿素a浓度结果，分光光度计三色法>分光光度计单色法>荧光法.测量方式不同对叶绿素a浓度结果的影响大于提取方式的不同对浓度结果的影响，并且不同提取或者测量方法得到的结果之间具有极好的线性关系.

叶绿素a浓度；分光光度计法；荧光法；微囊藻

叶绿素a(Chlorophyll a,简称Chla)是反映水体中浮游植物生物量的常用指标之一.从藻类细胞中提取色素可以在超声破碎[1]、组织研磨[2]，或超声破碎和组织研磨同时进行[3]的情况下进行.由于研磨方法容易导致色素的丢失，出现了很多改进的方法，如冻融法[4]和热浴法[5]等.很多学者都进行了各种提取方法的比较研究；然而，由于藻类组成的不同，各种萃取剂提取Chla的结果均不相同[6-7].提取的Chla可以使用分光光度计法和荧光法进行测量，其中分光光度计法分为三色法[8]和单色法[9]两种.一些学者针对Chla浓度的提取和测定方法进行了比较研究，例如：陈宇炜等[10]通过对比丙酮萃取与热乙醇萃取后认为，在单色方法中，热乙醇与丙酮具有很好的相关性，热乙醇法具有操作简便、快捷,萃取完全,低毒害等优点；李振国[11]对丙酮三色法与乙醇单色法进行了比较，结果表明，乙醇法的萃取效率高于丙酮法，但由于乙醇法实验条件的难以控制，其结果的方差较大；陈明华[12]对比了丙酮法和热乙醇法测定Chla的结果，发现二者之间有较好的线性关系，相比丙酮法，热乙醇法更具优势.

然而，当前的研究多侧重于提取方法或测量方法单独比较，而较少将二者结合起来讨论，并且较少讨论荧光测量与分光光度测量的差异.本文以实验室培养的微囊藻(Microcystis aeruginosa)为例，使用目前常用的丙酮直接浸提、冻融方法、热乙醇法和热丙酮方法进行Chla的提取，提取液采用分光光度法和荧光法进行测量，讨论不同浓度梯度下各种提取和测量方法对浓度结果的影响.

1 材料与方法

1.1 材料

微囊藻购自中国科学院水生生物所淡水藻种库.在实验室培养微囊藻样品，样品选自其对数生长期.

化学试剂：90%丙酮、90%乙醇、10% HCL、1 mol/L HCL；

实验仪器与材料：UV分光光度计、Turner Designs 700荧光仪；冰箱、水浴锅、抽滤装置、镊子、10 mL具塞玻璃管、比色皿、滴管、三角瓶、定性滤纸、GF/C滤膜.

1.2 实验方案

首先用超声震荡仪将待测样品进行匀化，以保证待测样品的均一性.本实验共分为两个阶段：第一个阶段是高浓度样品的测量，第二个阶段是低浓度样品的测量.其中高浓度样品直接选取培养的原始微囊藻浓度为初始浓度，并依次将其稀释2倍和4倍，得到三个不同浓度梯度的样品.低浓度样品是根据已知Chla浓度的样品进行稀释得到，稀释后使得各梯度的中心浓度值分别为120 μg/L、60 μg/L、30 μg/L和15 μg/L，得到4个浓度梯度.对7个不同浓度梯度的样品各设置三个平行样，然而对21个样本分别使用四种方法提取，提取的结果分别用三种不同的方式测量.

对于高浓度样本，随浓度梯度由高至低，抽滤体积依次为20 ml、25 ml、30 ml；低浓度所有样品抽滤体积均为20 ml.由于不同的滤膜对结果影响不大[13]，所有样品均用Whatman GF/C滤膜过滤，并用定性滤纸吸干后置于-20 ℃的冰箱中低温干燥保存.

1.3 叶绿素提取方法

本文使用目前常用的四种方法进行Chla含量的提取，其中丙酮直接浸提参照文献[14]，冻融法参照文献[15]，热乙醇法参照文献[9]，热丙酮参照文献[16].

1.4 叶绿素浓度测量和浓度计算

分别使用分光光度和荧光光度法对萃取后的液体进行测量.分光光度测量采用单色和三色两种方法，具体步骤为：取上清液进行比色测量并读取波长750 nm、663 nm、645 nm、630 nm和665 nm处的吸光度；再向液体中加入1滴l mol/L的盐酸进行酸化，摇匀后再次测定665 nm、750 nm处吸光度.荧光测量使用TD700荧光仪，测量时先直接读取萃取液的荧光值Fa，然后向液体中添加一滴10%的稀HCL，读取液体的荧光值Fb.TD700已使用Chla标准样品定标，可以直接读取出酸化后的Chla浓度值.

Chla浓度的三色法计算公式参见国家行业标准，单色法计算公式参见湖泊富营养化测量规范.数据的处理和分析使用Matlab7.0和SPSS16.0进行.

2 结果与讨论

2.1 不同提取方法对浓度结果的影响

将测量结果剔除由于操作误差产生的异常值，之后计算各样本的三个平行样测量结果的平均值和标准差.同时，为了衡量测量结果的稳定性，计算各平行样品的变异系数.考虑每种测量方法条件下，不同的提取方法对Chla结果的影响，以及该种影响在不同浓度梯度上的表现，其结果(见表1).

表1 各平行样品所测得浓度结果的变异系数

注：浓度1-7分别代表浓度梯度从高至低的7个等级.

由表1可以看出，除了个别样品外，在高浓度和低浓度样品下，不同平行样结果的变异系数均低于0.1.说明三个平行样的结果具有较好的一致性，测量操作误差较小.因此，可取各样本三个平行样的平均值用于分析.

由图1可以看出，在单色法测量结果中，热丙酮法萃取效果最好，其它三种方法结果差异不大，并且热丙酮法测量结果显著偏高的趋势在高浓度梯度下表现得更为明显.其中浓度梯度二中冻融法和直接浸提法结果优于热丙酮法，该异常是由操作误差引起.单色法测量中，高浓度梯度下不同提取结果相差94 ug/L，低浓度梯度下不同提取结果相差10.8 ug/L.

图1 各种测量方法下不同方法提取结果差异

在三色法测量结果中，高浓度梯度下，冻融法萃取效果最好，而低浓度梯度下，热丙酮效果更优.直接浸提、热乙醇法、热丙酮法和冻融法提取结果依次升高，并且该趋势在高浓度下表现得更为明显.三色法测量中，高浓度梯度下不同提取结果相差98 ug/L，低浓度梯度下不同提取结果相差25 ug/L.

在荧光法测量结果中，高浓度梯度下，直接浸提、热乙醇法、热丙酮法和冻融法提取结果依次降低；在低浓度梯度下，热丙酮法结果最好.在浓度梯度一中热丙酮法测量显著偏低是由于操作误差导致.荧光法测量中，高浓度梯度下不同提取结果相差94 ug/L，低浓度梯度下不同提取结果相差1 ug/L.

可以看出，热丙酮法萃取的单色测量结果较好；冻融法或热丙酮法萃取的三色法测量结果较好；直接浸提或热丙酮法萃取的荧光法测量结果最好.其中，在各种测量方法中热丙酮法提取均可取得较高的效率.

2.2 不同测量方法对浓度结果的影响

分别考虑每种提取条件下，不同测量方法对结果浓度产生的影响，以及该种影响在不同浓度梯度上的表现.四种不同的提取方法下各种测量方法所得的Chla结果(见图2).

由图2可以看出，对于单色法测量和三色法测量的结果比较，直接浸提法得到的二者结果相差不大，且三色法结果略高于单色法；热乙醇法得到的结果，三色法结果高于单色法，并且三色法比单色法结果高的趋势在高浓度梯度下表现得更明显；热丙酮法得到的结果，三色法结果高于单色法，并且三色法比单色法结果高的趋势在低浓度梯度下表现得更明显；冻融法结果中，三色法结果显著高于单色法，并且在高浓度和低浓度梯度下该趋势均较明显.

三色法和荧光法的差异，在每种提取方法均表现为三色法远大于荧光法，且该差异在高浓度梯度下表现得较为明显.分光光度计单色法与荧光法测量结果的差异与三色法与荧光法的结果差异相似，但在低浓度样品下，单色法与荧光法的结果具有可比性.因此，不同测量方法得到的结果浓度，分光光度计三色法>分光光度单色法>荧光法.

图2 四种提取方法下各种测量方法的Chla浓度梯度结果差异

2.3 提取和测量对结果浓度的影响分析

由分析可知，使用同一种测量方法时，不同的提取方法得到的结果浓度相差不大，其中在高浓度下相差值为98 ug/L，相对误差为6.2%；在低浓度下相差值为25 ug/L，相对误差为44.9%.

使用同一种提取方法时，不同的测量方法得到的结果浓度相差较大，其中三色测量与荧光测量的结果相差最为显著，在高浓度下二者相差值为779 ug/L，相对误差为49.5%；在低浓度下相差值为24 ug/L，相对误差为66%.产生这种现象的原因是荧光测量与分光光度计的三色测量方法所使用的仪器与计算方法均不相同.无论样品浓度梯度高低，采用何种提取方法，不同的测量方法对结果浓度的影响均较大.

由于二类湖泊水体的Chla浓度范围多在5～150 μg/L内，浓度范围较低，不同的提取方法和不同的测量方法对结果浓度的影响均较为显著.因此，平时的实验工作中，应尽量选择同一种提取和测量方法，从而使结果具有可比性.

2.4 不同提取方法与测量方法结果间的关系

首先考虑不同的提取方法测量得到的浓度间的关系.将各种提取方法下7个浓度梯度所测得的Chla结果作矩阵散点图(提取液体的三种不同测量方式近似作为三个样本，因此共有7×3=21个样本).然后考虑不同测量方法所得结果的关系，同样将不同的提取方法作为样本进行分析.得到的矩阵散点图(见图3).

由图3可以看出，四种提取方式所得到的结果浓度之间具有较高的相关性.相关系数矩阵中显示，两两之间的相关系数均在0.96以上，其中直接浸提、热乙醇法和热丙酮法三者间相关系数均在0.99以上.冻融法测量结果中一个样点由于操作误差而导致相关系数较低.同时，由测量得到的Chla矩阵散点图看出，低浓度的样点偏离直线较小，而高浓度样点偏离直线较大，说明浓度越大，不同提取方法的相关性越不明显.

三色法、荧光法与单色法测量得到的Chla之间的相关系数均在0.97以上，三种测量方法所得的结果具有可比性.根据图3，如果不考虑异常样点的影响，分光光度计的单色法和三色法相关系数最好，而荧光测量与分光光度测量的相关系数较低，这是由于不同的测量仪器对测量结果的影响较大.

图3 不同提取与测量结果的矩阵散点图

综上所述，不同提取方法、不同测量方法所得到的Chla浓度虽然不同，但各种方法的结果却具有良好的线性关系.在实际工作过程中，同一种提取和测量方法所得的结果有利于数据的对比分析，而不同的提取和测量方法得到的结果也可以相互换算.

3 结 论

(1)热丙酮法萃取Chla并使用单色测量结果较好；冻融法或热丙酮法萃取并用三色法测量结果较好；直接浸提或热丙酮法萃取的荧光法测量结果最好.热丙酮法提取的结果在各种测量方法中均可取得较好的效果.不同测量方法得到的结果浓度，分光光度计三色法>分光光度单色法>荧光法.

(2)如果固定测量方式，不同的提取方法对结果浓度影响较小，且在低浓度条件下影响较为显著.如果固定提取方式，无论样品浓度的高低，不同的测量方法对结果浓度的影响均较为显著.

(3)不同的提取方法或测量方法得到的结果之间具有一定的相关性，其结果值可以相互转换.

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ComparisonofDifferentMeasurementsonChlorophyllaConcentrationofPhytoplanktoninWater

CHENG Chun-mei, HUANG Wei-duo, ZHANG Wei

(College of Surveying and Municipal Engineering, Zhejiang University of WaterResources and Electric Power, Hangzhou 310018, China)

Chlorophyll a is an important indicator of phytoplankton biomass in water, and accurate determination of its content is of great significance. Taking Microcystis aeruginosa cultivated in the laboratory as the research object, this paper compares four different extraction methods and three different measurements used currently. Experimental results show that chlorophyll a concentration extracted by hot ethanol method is most effective, and chlorophyll a concentration measured by different methods, three-color spectrophotometry>single-color spectrophotometry>fluorescence method. Measurement difference has more effects on the chlorophyll a concentration result than extraction difference, and chlorophyll a concentration extracted or measured by different methods has high linear relationship.

Chlorophyll a concentration; spectrophotometry; fluorescence method; Microcystis aeruginosa

2016-08-23

浙江省教育厅科研基金资助项目(Y201534666)；浙江水利水电学院大学生创新训练项目(20150525018)

程春梅(1987-)，女，湖北武汉人，博士，讲师，主要研究方向为水环境遥感与地理信息系统.

Q948.8

A

1008-536X(2016)12-0059-05