血痛定喷雾剂的制备及体外凝血作用的研究

侯 君，郑德志，李聃丹，于波涛，呼永河

·论著·

血痛定喷雾剂的制备及体外凝血作用的研究

侯 君，郑德志，李聃丹，于波涛，呼永河

目的制备中药血痛定喷雾剂，并考察其对体外凝血指标的影响。方法通过高分子材料PCEC合成、制备可同时传输疏水性（独一味、祖师麻）和亲水性药物（三七）的高效透皮给药的中药外用喷雾剂——血痛定喷雾剂。结果制备的血痛定喷雾剂纳米粒呈圆形颗粒状分布，峰形单一，平均粒径32.86 nm，带负电荷，电位-1.79 mV。随着喷雾剂浓度的增加，体外凝血酶时间、部分激活的凝血酶时间降低，凝血酶原时间呈不规律性变化，纤维蛋白原呈先递减后递增的趋势。结论成功制备血痛定喷雾剂，明确其对体外凝血指标的止血作用。

血痛定；喷雾剂；PCEC；高效透皮传输给药系统

血痛定组方包含三七、独一味、祖师麻等，其中三七，味甘、微苦，性温，功能散瘀止血，用于外伤出血，跌扑肿痛[1]。独一味，甘、苦，性平，功能活血止血，主用于跌打损伤，外伤出血[2]。上二药配伍，活血止血，化瘀定痛，针对“筋伤”病机血不循经，瘀血阻滞病机。祖师麻，辛苦，温，功能祛风湿、散瘀、止痛，针对“筋伤”外风入络，以助君药祛风化瘀止痛[3]。因此，血痛定具有较好的止血作用。本研究拟采用高分子材料合成、制备可同时传输疏水性和亲水性药物的高效透皮缓释给药系统，促进血痛定中有效成分的透皮吸收、传输，制备具有快速、高效止血作用的中药外用喷雾剂。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 己内酯、PEG4000、辛酸亚锡等购于国药集团；三七、独一味、祖师麻提取物由本实验室制备。Varian 400型核磁共振氢谱（美国Varian公司）；X’Pert Pro型 X-射线衍射仪 (荷兰Philips公司)；APV 2000型高压匀质机（德国APV公司）；MDF382E型超低温冰箱（日本sanyo公司）；Zetasizer 3000型粒度与电势分析仪(英国Malvern公司)；tec-10型透射电子显微镜(荷兰Philips公司)；CA510型全自动血凝仪（日本sysmex公司）。

1.2 实验动物 家兔购于四川大学实验动物中心（许可证号：川实动管字第71号）。

1.3 血痛定喷雾剂的制备

1.3.1 聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯（PCL-PEGPCL）共聚物PCEC的合成[4]按比例将己内酯、PEG4000及辛酸亚锡（0.5%w/w，辛酸亚锡所加的量为PEG2000的0.5%）加入到三口烧瓶中。通过机械搅拌和氮气保护，在130℃油浴中反应6 h，温度升到180℃并抽至真空。20 min后终止反应，待温度降到室温后，用二氯甲烷溶解聚合物，然后将其倒入冷石油醚中沉淀，过滤，在通风橱中使溶剂挥发，真空干燥备用。

1.3.2 PCEC的表征鉴定 （1）分子结构鉴定：核磁共振氢谱1H-NMR表征PCEC分子结构，聚合物被溶解到CDCl3。（2）结晶性能鉴定：X-射线衍射XRD表征聚合物材料的结晶性能，Cu Kα作靶。

1.3.3 载药纳米粒制备 将独一味、祖师麻提取物与PCEC溶于乙酸乙酯中，然后加入三七提取物的水溶液（浓度为1 g/ml），3药提取物皆占PCEC质量的1%，PCEC的用量为乙酸乙酯质量的5%。高速匀浆机乳化，转速10 000 r/min，形成油包水的乳液；加入含50 ng/ml泊洛莎姆的水溶液中，再乳化，形成水包油包水的复乳。旋转蒸发仪40℃减压蒸发20 min，使乙酸乙酯挥发，即得载药纳米粒。

1.3.4 载药纳米粒质量控制 （1）粒径分布测定：测试温度为25℃，重复测试3次，取平均值。（2）ζ电位测定：测试温度为25℃，重复3测试次，取平均值。（3）形貌分析：胶束用蒸馏水稀释，滴到铜网上，磷钨酸负染，室温下干燥后透射电镜观察。

1.4 血痛定喷雾剂止血作用研究[5]

1.4.1 溶液配制

1.4.1.1 样品溶液配制 精密称定冻干血痛定喷雾剂粉末0.2 g，定容至100 ml容量瓶中，配制成为2 mg/ml的储备液，临用前稀释成0.01～0.2 mg/ml溶液。

1.4.1.2 阳性对照药物溶液的配置 精密称取云南白药粉0.3 g，定容至100ml容量瓶中，配制成为3 mg/ml储备液，临用前配制成为 0.15 mg/ml的阳性对照溶液。

1.4.2 血浆制备 健康家兔，雄性，体重2.5～3.0 kg，采血前24 h禁食，自由饮水。耳缘静脉取血，3500 r/min离心10 min，收集上清，在-18℃冰箱保存。

1.4.3 血痛定喷雾剂对凝血酶时间（TT）的影响吸取血浆、蒸馏水，各浓度的血痛定溶液及云南白药阳性对照各30 μl至比色杯，预热2 min，吸取30 μl的TT试剂至该比色杯，每组平行测定3份。

1.4.4 血痛定喷雾剂对凝血酶原时间（PT）的影响

吸取血浆、蒸馏水，各浓度的血痛定溶液及云南白药阳性对照各30 μl至比色杯，预热2 min，吸取30 μl的PT试剂至该比色杯，每组平行测定3份。

1.4.5 血痛定对部分激活的凝血酶时间（APTT）的影响 吸取血浆、蒸馏水，各浓度的血痛定溶液及云南白药阳性对照各30 μl至比色杯，预热2 min，吸取30 μl的CaCl2试剂至该比色杯，每组平行测定3份。

1.4.6 血痛定对纤维蛋白原（FIB）的影响 吸取血浆、蒸馏水，各浓度的血痛定溶液及云南白药阳性对照各40 μl至比色杯，预热2 min，吸取20 μl的FIB试剂至该比色杯，每组平行测定3份。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血痛定喷雾剂的制备及质量表征

2.1.1 PCEC的质量表征 PEG的亚甲基特征峰值出现在3.65 ppm，4.18 ppm吸收峰则是PCL的-OCH2-CH2O-CO(CH2)5CO-的特征峰，说明PEG与PCL是由酯键相连的三嵌段共聚物（图1）。图2衍射峰单一而尖锐，说明PCEC的结晶性能良好。

图1 核磁共振氢谱1H-NMR表征PCEC特征峰

图2 X-射线衍射XRD表征PCEC结晶性能

2.1.2 血痛定喷雾剂的质量表征 图3为载药纳米粒的透射电镜图，表明载药纳米直径＜50 nm。图4为载药纳米粒的粒径分布图，表明该纳米粒的平均粒径尺寸为32.86 nm，峰形单一说明载药纳米粒粒度分布均匀；图5为载药纳米粒电位分析图，所测得该纳米粒的电位为-1.79 mV。

图3 载药纳米粒的透射电镜图

图4 载药纳米粒的粒径分布

图5 载药纳米粒的电位图

2.2 血痛定喷雾剂止血作用评价

2.2.1 对TT的影响 随着喷雾剂浓度增加，TT缩短，有利于快速止血，优于阳性对照组结果（表1）。

2.2.2 对PT的影响 随着喷雾剂浓度增加，PT呈不规律性变化（表2）。

表2 各组血桨凝血酶原时间比较(n=4)

2.2.3 对APTT的影响 随着喷雾剂浓度增加（0.08～0.15 mg/ml），APTT呈递减趋势，优于阳性组，但继续增加喷雾剂浓度 （0.2 mg/ml），APTT反而增加（表3）。

2.2.4 对FIB的影响 随着喷雾剂浓度增加，FIB呈先递减后递增的趋势，阳性组优于喷雾剂组（表4）。

3 讨论

本研究运用现代纳米技术，对临床验方进行中药有效成分或部位的研究与开发，避免了传统中药在加工过程中繁琐的处理工序，使之形成纳米中药复方制剂，有利于药物的规范化研究、开发、生产，大大提高了该制剂的现代化和标准化程度。血痛定喷雾剂是一种新型止血制剂，有效成分为PCLPEG-PCL共聚物。PCL是一种生物可降解、生物相容好的半结晶聚合物，它以微球、纳米粒子和植入材料的形式在不同的药物传输系统中得到了应用。由于PCL的高结晶度和强疏水性，使得PCL降解缓慢，并且疏水的PCL纳米粒子在静脉注射后会很快被网状内皮系统清除。纯PCL粒子在水中很不稳定，非常容易发生聚集。为了解决上述问题，课题组对PCL纳米粒做了多种修饰，其中聚乙二醇（PEG）化的PCL纳米结果最好。PEG化可使疏水性高分子纳米粒具有两亲性，生物相容性提高，降解速度和药物释放行为可控，体内循环时间延长。这些特点使PEG化的PCL纳米粒比纯PCL纳米粒在给药系统中更有应用前景。

表1 各组血桨凝血酶时间比较（n=4）

表3 各组血桨部分激话的凝血酶时间比较(n=4)

表4 各组血桨纤维蛋白原比较(n=4)

凝血酶在止、凝血中发挥了重要的作用。PT值反映外源性凝血因子，APTT反映内源性凝血因子，TT值反映凝血共同途径纤维蛋白原转变为纤维蛋白的抗凝过程。本研究发现，血痛定喷雾剂不能缩短PT和FIB，但可以显著缩短APTT和TT值。因此推测，血痛定喷雾剂体外止血作用可能是影响抗凝系统和内源性凝血因子起作用，而对外源性凝血因子和纤溶系统影响不大。

综上所述，血痛定喷雾剂如能应用临床，可作为外科手术的重要辅助工具，极具临床应用前景。同时血痛定喷雾剂适合军地两用，具有极大的军事和社会意义。

[1] 张子龙,王文全.三七本草研究概述[J].世界科学技术(中医药现代化),2010,12(2):271-276.

[2] 王煌,张智艳,程明和,等.独一味化学成分研究进展与临床应用[J].药学实践杂志,2006,24(2):73-75.

[3] 李书慧,吴立军,殷红英.祖师麻化学和药理活性研究进展[J].中国中药杂志,2002,27(6):401-403.

[4] 黄安亮,成丽.新型靶向FAK基因shRNA的阳离子PCEC纳米材料制剂对人乳腺癌增殖和凋亡的影响[J].华西药学杂志, 2009,24(4):345-348.

[5] 向金,莲程睿,张路晗.血竭的活血和止血作用研究[J].华西药学杂志,2000,15(6):430-434.

Preparation and in vitro hemostatic effects of Xuetongding Spray

Hou Jun1,Zheng Dezhi2,Li Dandan3,Yu Botao1,Hu Yonghe41.Department of Pharmacy,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China;2.Department of Cardiovascular Surgery,General Hospital of Jinan Military Command, Jinan,Shandong,250031,China;3.Base for Drug Clinical Trail,Xinqiao Hospital Affiliated to Third Military Medical University, Chongqing,400037,China;4.Centre for High Humid Environment and Military Medicine,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

Objective To prepare TCM Xuetongding Spray and observe its impacts on in vitro coagulation indexes.MethodsXuetongding Spray,the effective cutaneous TCM penetration for external use transmitting both hydrophobic drugs(Duyiwei and Zushima)and hydrophilic drugs (Sanqi)was synthetized and prepared with polymers PCEC.ResultsThe nanoparticles of Xuetongding Spray were round and uniform ly distributed,displayed a single peak.The average diameter was 32.86 nm,with negative charge and a potential of-1.79 mV.With the increase of spray concentration,the thrombin time in vitro and activated partial thrombin time decreased;the prothrombin time showed irregular changes;the fibrinogen decreased progressively first and then increased progressively.ConclusionXuetongding Spray is successfully prepared to identify its hemostatic effect in vitro.

Xuetongding Spray;PCEC;effective transdermal drug administration system

R 283

A

1004-0188（2016）12-1401-05

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.014

2016-07-22）

四川省科技厅科技支撑项目（2014SZ0037）；2014年度全军后勤科研项目（BWS14J023）

610083成都，成都军区总医院药剂科（侯 君，于波涛）,高湿环境军事医学研究中心（呼永河）;济南军区总医院心血管外科（郑德志）；第三军医大学新桥医院临床药理基地（李聃丹）；

呼永河，电话：028-86570206；E-mail：huyonghezyy@163. com