C肽对高糖下肾足细胞凋亡和肾病蛋白的影响

游志清，郎红梅，程 莹，刘君静，任 丽，万 勇，郭 蔚，李宁娜，艾智华

C肽对高糖下肾足细胞凋亡和肾病蛋白的影响

游志清，郎红梅，程 莹，刘君静，任 丽，万 勇，郭 蔚，李宁娜，艾智华

目的探讨C肽对高糖下肾足细胞凋亡和肾病蛋白的影响。方法将肾足细胞分成4组：对照组（5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（25 mmol/L葡萄糖，下同）、C肽组（高糖+C肽）、百日咳毒素（PTX）组（高糖+C肽+PTX），干预24 h后，Western blot检测磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）和mTOR蛋白，免疫荧光法检测肾病蛋白，TUNEL一步法检测足细胞凋亡。结果5 nmol/L C肽即能显著抑制高糖下足细胞mTOR的表达（P＜0.01）。与对照组相比，高糖组PI3K、Akt和 mTOR表达显著升高（P＜0.05），肾病蛋白表达显著下降（P＜0.01），足细胞凋亡显著增加（P＜0.01）；与高糖组相比，C肽能逆转高糖所致的上述变化 （P＜0.01），而PTX能消除或减弱C肽的上述逆转作用 （P＜0.05）。结论C肽可抑制高糖激活的足细胞PI3K-Akt-mTOR信号通路，并减少高糖所致的足细胞肾病蛋白减少和足细胞凋亡。

C肽；足细胞；雷帕霉素靶蛋白；肾病蛋白；凋亡

足细胞在肾小球滤过屏障和结构完整性方面起到非常重要的作用，其受损是糖尿病肾病发生的重要启动因素[1]。足细胞内mTOR活性的异常，可能是糖尿病肾病发生的关键因素[1-2]。在高糖刺激下，足细胞mTOR的活性明显升高，导致肾小球肥大和基质合成增加，后者又导致基底膜和系膜增厚[3]。在1型糖尿病患者及大鼠的肾小球足细胞内，mTOR的活性明显升高，并与尿白蛋白排泄呈明显正相关[4]。PI3K-Akt-mTOR信号通路是经典的调节mTOR活性的通路。越来越多的证据表明，C肽是具有生物学功能的肽，可调节细胞内多种信号通路，生理浓度范围C肽能减轻1型糖尿病患者肾小球的高滤过状态，减少尿白蛋白排泄[5-6]，但其机制尚未明了。因此，本研究旨在探讨C肽是否对足细胞内 PI3K-Akt-mTOR信号通路有调控作用及其对足细胞肾病蛋白和凋亡的影响，以进一步阐明C肽的肾保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1 试剂 小鼠肾足细胞（含tsSV40T序列）（江阴康众康民生物医药技术有限公司，中国无锡）；胎牛血清（Hyclone，美国)；青-链霉素双抗(GIBCO，美国)；DMEM培养基(GIBCO，美国)；胰蛋白酶(Trypsin)(上海生工生物工程有限公司)；PI3K，Akt，mTOR多克隆抗体（santaz cruz，美国），兔抗nephrin多克隆抗体（博奥森，bs-10233），Alexa Flour 488标记山羊抗兔抗体 （碧云天，A0423）；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）（碧云天）。人C肽（上海南方模式生物科技发展有限公司）；百日咳毒素（EBZO，美国）；葡萄糖（上海生物工程有限公司）。

1.1.2 仪器 二氧化碳培养箱 (TC2323型，SHELDON，美国)；倒置相差显微镜(XDS-1型，重庆光学仪器厂)；电子天平 (Shangping JA 21002，上海天平仪器厂)；凝胶扫描成像系统(Bio-Rad，美国)；TE2000-U倒置荧光显微镜(Nikon，日本)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将小鼠肾足细胞用DMEM低糖培养基(含10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗)于37℃，5%CO2条件下培养。当培养瓶中细胞融合至80%左右时开始传代，经3～5次传代，将细胞以5000个/cm2的密度接种至玻片上，给予无血清培养基饥饿24 h行干预实验。

1.2.2 梯度实验 将足细胞分为5组，分别是对照组(Cont组)（5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（25 mmol/L葡萄糖，下同）(HG组)、高糖+1 nmol/L C肽组(1 nMC肽组)、高糖+5 nmol/L C肽组(5 nMC肽组)和高糖+ 10 nmol/L C肽组(10 nMC肽组)。干预24 h后，提取细胞总蛋白用于Western blot实验检测mTOR，确定C肽的最适干预浓度为5 nmol/L（表1）。

1.2.3 干预实验 将足细胞分为分为4组，Cont组（同上）、HG组（同上）、高糖+5 nmol/L C肽组(C肽组)和高糖+5 nmol/L C肽+100 ng/ml PTX组(PTX组)，干预时间均为24 h。干预结束后，提取细胞总蛋白，Western blot检测PI3K、Akt和mTOR蛋白水平，具体检测方法参照各试剂盒说明书，凝胶成像系统扫描分析条带光密度值(OD值)，计算各蛋白条带光密度值与内参照GAPDH光密度值的比值。免疫荧光法检测足细胞上nepherin蛋白，按试剂盒说明书操作，在TE2000-U倒置荧光显微镜下观察，用NISElements成像软件照相和蛋白定量分析，以对照组的荧光值为1，计算其他组的荧光值与其的比值作为其蛋白定量值。

1.2.4 足细胞凋亡检测 采用一步法TUNEL检测细胞凋亡，足细胞在玻片上生长融合至70%～80%时，从培养箱中取出。倒去培养液，PBS洗涤1次。免疫染色固定液（碧云天）固定30 min。PBS洗涤一次。加入含有0.1%Trinton X-100的PBS，冰浴孵育2 min。配置TUNEL检测液，充分混匀。PBS洗涤2次，在样品上加50 μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min。PBS洗涤3次，每次5 min。用抗荧光淬灭封片液后，荧光显微镜下观察计数凋亡细胞。

1.3 统计学方法 应用GraphPad.Prism.v5.0统计软件进行分析，计量资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同条件下mTOR表达 5 nmol/L的C肽对高糖诱导的足细胞mTOR表达的抑制作用最强（P＜0.01）。见表1。

表1 不同条件下mTOR的表达

2.2 不同条件下足细胞PI3K、Akt和mTOR肾病蛋白表达和凋亡 高糖可诱导足细胞PI3K、Akt和mTOR蛋白高表达，肾病蛋白表达下降，足细胞凋亡增加；C肽能逆转高糖所致的上述变化 （P＜0.01），而PTX能消除或减弱C肽的上述逆转作用 （P＜0.05）。见表2、图1、2。

图1 不同条件下足细胞PI3K、Akt和m TOR蛋白的表达

表2 不同条件下足细胞pI3K、Akt、mTOR、肾病蛋白表达和凋亡情况

图2 不同条见下足细胞肾病蛋白表达和足细胞凋亡（白色箭头指示）情况

3 讨论

本研究发现，5 nmol/L的C肽（生理浓度范围内）能抑制高糖诱导的肾足细胞mTOR表达增加，而再提高C肽浓度并不能增加这种抑制能力。PI3K、Akt处于PI3K-Akt-mTOR信号通路的上游，是调节mTOR表达的重要路径[7]。本研究结果显示，高糖下，足细胞PI3K、Akt表达也增加，提示高糖是通过激活PI3K-Akt途径，调节mTOR表达增加。还发现C肽也能抑制高糖环境下足细胞PI3K、Akt的高表达。文献报道，PTX能阻断C肽逆转高糖下肾小管上皮细胞纤维化的作用[8]。因此，PTX被认为是C肽的阻断剂。本研究也观察到，C肽抑制高糖诱导的肾足细胞PI3K-Akt-mTOR高表达作用被PTX阻断。因此，在高糖环境下，生理浓度C肽对PI3K-AktmTOR信号通路可能有抑制作用。

Inoki等[1]通过特异性敲除鼠足细胞mTOR复合体1基因上游的抑制性调节子后，鼠足细胞内mTOR复合体1活性明显升高，并复制出了糖尿病肾病的特征：足细胞丢失，肾小球基底膜增厚，系膜基质增加和蛋白尿形成。提示足细胞mTOR复合体1活性升高与糖尿病肾病的发生密切相关。足细胞膜上的肾病蛋白是肾小球基底膜中裂孔膜的重要组成，主要分布在细胞膜表面，起作阻止蛋白滤过的作用。本实验发现，在高糖下肾病蛋白表达显著下降，提示高糖下肾小球基底膜上裂孔膜屏障受损。生理浓度C肽能逆转高糖对肾病蛋白的这种作用。同样地，C肽的这种作用也被PTX阻断，鼠足细胞内mTOR复合体1被激活引起肾病蛋白表达显著减少并移位[1]。因此，C肽逆转高糖环境对足细胞肾病蛋白表达的影响，可能与C肽抑制高糖诱导mTOR高表达有关。

同时，25 mmol/L葡萄糖刺激下，足细胞凋亡较5 mmol/L生理浓度葡萄糖刺激下明显升高，而5 nmol/L的生理浓度C肽能显著减少高糖刺激下的足细胞凋亡。同样地，C肽逆转高糖诱导的肾足细胞凋亡的这种作用也被PTX阻断。Eid等[8]报道，高糖通过增加mTOR活性，促进肾足细胞凋亡，推测C肽可能通过抑制高糖激活的PI3K-Akt-mTOR通路，减少足细胞凋亡。

综上所述，高糖环境下，肾小球足细胞PI3K-Akt-mTOR通路被激活，导致足细胞膜上的肾病蛋白表达下降，使肾小球基底膜中裂孔膜滤过屏障受损；同时，促进肾足细胞凋亡，二者可能是引起蛋白尿的重要原因。但生理浓度的C肽能逆转高糖的前述作用。因此，C肽在防治1型糖尿病肾病中可能具有重要作用。鉴于Akt及mTOR对于足细胞功能及存活影响的复杂性，还需进一步研究，如观察Akt或mTOR的磷酸化情况。

[1] Inoki K,Mori H,Wang J,et al.mTORC1 activation in podocytes is a critical step in the development of diabetic nephropathy in mice[J].J Clin Invest,2011,121(6):2181-2196.

[2] Göde M,Hartleben B,Herbachet N,et al.Role of mTOR in podocyte function and diabetic nephropathy in humans and mice [J].J Clin Invest,2011,121(6):2197-2209.

[3] Lieberthal W,Levine JS.The role of the mammalian target of rapamycin(mTOR)in renal disease[J].J Am Soc Nephrol,2009, 20:2493-2502.

[4] Siroky1 BJ,Bitzer M.The growing importance of mTORC1-S6K1 signaling in kidney[J].Am J Physiol Renal Physiol,2009,297(3): F583-584.

[5] Hills CE,Brunskill NJ,Squires PE,et al.C-Peptide as a therapeutic tool in diabetic nephropathy[J].Am J Nephrol,2010, 31(5):389-397.

[6] Hills CE,Al-Rasheed N,Al-Rasheed N,et al.C-peptide reverses TGF-beta1-induced changes in renal proximal tubular cells: implications for treatment of diabetic nephropathy[J].Am J Physiol Renal Physiol,2009,296(3):F614-621.

[7] Lu MK,Gong XG,Guan KL.mTOR in podocyte function:is rapamycin good for diabetic nephropathy[J]?Cell Cycle,2011,10 (20):3415-3416.

[8] Eid AA,Ford BM,Bhandary B,et al.Mammalian target of rapamycin regulates Nox4-mediated podocyte depletion in diabetic renal injury[J].Diabetes,2013,62(8):2935-2947.

Effects of C peptide on nephrin and apotosis in podocyte under high glucose

You Zhiqing,Lang Hongmei,Cheng Ying,Liu Junjing,Ren Li,Wan Yong,Guo Wei,Li Ningna,Ai Zhihua Department of Endocrinology,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

Objective To explore the effects of C peptide on nephrin and apotosis in podocyte under high glucose.Methods Podocytes were divided into four groups:the control group (5 mmol/L glucose),the high glucose group (25 mmol/L glucose),the C peptide group(HG+C peptide),and the pertussis toxin(PTX)group(HG+C peptide+PTX).24 hours after the intervention,the levels of phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K),protein kinase B(Akt)and mTOR protein were detected by use of Western blotting method.The levels of nephropathy protein were detected by immunofluorescence.Podocyte apoptosis was detected by one-step method of TUNEL.Results5 nmol/L C peptide could significantly inhibit the expression of podocyte mTOR (P＜0.01).Compared with the control group,the levels of PI3K,Akt and mTOR in the high glucose group increased greatly (P＜0.05),the levels of nephropathy protein decreased significantly(P＜0.01),and podocyte apoptosis obviously increased (P＜0.01);compared with the high glucose group,C peptide could reverse the above changes caused by high glucose(P＜0.01),while PTX could eliminate or weaken the above reverse effect of C peptide(P＜0.05).ConclusionC peptide can inhibit the podocyte PI3K-Akt-mTOR signal channel activated by high glucose and lower the reduction of podocyte nephropathy protein and podocyte apoptosis.

Cpeptide;podocyte;mTOR;nephropathy protein;apotosis

R 692

A

1004-0188（2016）12-1413-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.017

2015-10-29）

四川省卫生厅科研课题（120567）

610083成都 成都军区总医院内分泌科