N-乙酰半胱氨酸对新生鼠坏死性小肠结肠炎保护作用

蒋月娟，陈 霞

N-乙酰半胱氨酸对新生鼠坏死性小肠结肠炎保护作用

蒋月娟，陈 霞

目的探讨N-乙酰半胱氨酸（NAC)对坏死性小肠结肠炎（NEC）SD新生大鼠模型肠道损伤的保护作用。方法3日龄SD大鼠40只随机分为4组：NEC模型组、NAC对照组、生理盐水对照组、NEC模型+NAC组，每组10只。通过缺氧复氧冷刺激5 d制备NEC模型，此后，除NEC模型组外，其余3组给予NAC（100 mg/次）或生理盐水（5 ml/次）灌胃，1次/d，共5 d。各组在实验第5、10 d分别处死5只大鼠，解剖回盲部近端肠管行病理学检查，静脉血测定血清丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）和超氧化物酶（SOD）水平。结果NEC模型组实验中共死亡2只，其余组无死亡。NEC模型+NAC组和NEC模型组第10 d肠道组织病理评分均高于生理盐水对照组和NAC对照组（P＜0.05），NEC模型+NAC组评分低于NEC模型组（P＜0.05）。在实验后第5 d及第10 d，NEC模型组血清抗氧化活显著低于NAC对照组、生理盐水对照组（P＜0.05），也显著低于NEC模型+NAC组（P＜0.05），提示NAC可明显提高血清抗氧化活性（P＜0.05）。结论NAC可以减轻NEC大鼠模型肠道组织病理损伤，提高机体抗氧化水平，具有良好的肠道保护作用。

小肠结肠炎；坏死性；N-乙酰半胱氨酸；抗氧化；大鼠

坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生儿阶段严重的胃肠道疾病，虽然近年来新生儿救治技术不断提高，但该病死亡率仍居高不下，因此，寻求对NEC安全、有效的干预措施，已成为全世界新生儿科医师研究的热点之一[1]。近年来，NEC的致病机制研究已取得较大进展，其中氧自由基产生过多在NEC病情进展中起着重要作用[2]。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC)因具有较强的抗氧化活性[3]，使其用于NEC的防治成为可能。本研究通过对坏死性小肠结肠炎新生鼠模型给予NAC治疗，探求NEC的新防治措施。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选用3日龄SD新生大鼠40只，雌雄不限，体重5～10 g，室温15～25℃饲养（均人工喂养），自然采光，由第三军医大学大坪医院动物实验所提供（合格证编号SCXK渝2007-0005）。40只大鼠随机分为NEC模型+NAC组、NEC模型组、生理盐水对照组、NAC对照组4组，每组10只。

1.2 主要试剂和仪器 N-乙酰半胱氨酸（海南赞邦制药有限公司），丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）和超氧化物酶（SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），CY-12C型袖珍式数显测氧仪（建德市梅电化分析仪器厂）。根据实验需要自制有机玻璃密闭缺氧舱及新生鼠保育箱。

1.3 方法

1.3.1 模型制备 按照既往研究方法[4]和本课题组的经验。NEC模型+NAC组和NEC模型组行缺氧复氧冷刺激：密闭缺氧箱入气孔充入纯氮，流量15 L/min，将实验鼠立即置于箱内，持续充入氮气，维持100%氮气10 min后，置于室内复氧10 min，立即置于4℃冰箱内10 min。每日定时刺激1次，连续5 d。模型制备成功后，NEC模型+NAC组继续给予NAC灌胃，100 mg/次，1次/d，连续5 d；NEC模型组不给予任何治疗。生理盐水对照组和NAC对照组不给予缺氧复氧冷刺激，5 d后生理盐水对照组给予生理盐水灌胃，3 ml/次，1次/d；NAC对照组给予NAC灌胃，100 mg/次，1次/d，两组均连续给予5 d。

1.3.2 人工喂养方法 采用8号灌胃针进行灌胃，确认针头进入胃内后注入雀巢低出生体重奶，0.3 ml/次，3次/d。

1.4 观察指标

1.4.1 生长情况及一般情况 各组大鼠每日定时称量体重，观察实验鼠是否有体重增长缓慢、活动减少、倦怠、大便颜色性状发生改变，对刺激反应迟钝、活动缓慢、皮下脂肪减少，喂养过程是否有喂养困难、吐奶、进奶量下降等表现。

1.4.2 血清MDA、GSH-PX、SOD水平检测 各组在缺氧复氧冷刺激5 d（即模型形成后，8日龄）和10 d（即给予NAC或生理盐水灌胃5 d后，13日龄）时，分别取5只大鼠处死，取静脉血测定血清MDA（化学比色法，试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所）、GSH-PX（化学比色法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所）、SOD活力（WST法，试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所）。

1.4.3 肠组织病理学观察 取回盲部近端肠管1～2 cm，立即固定于10%甲醛，再制成组织切块，在石蜡切片机上行冠状切片，约4～5 μm厚度连续切片，常规HE染色，光镜下观察。肠道组织病理评分参考Nadler标准进行评分：0分：肠道绒毛及上皮完整，组织结构正常；1分：轻微黏膜下或固有层肿胀分离；2分：中度黏膜下和/或固有层分离，黏膜下和/或肌层水肿；3分：重度黏膜下和/或固有层分离，黏膜下和/或肌层水肿，局部绒毛脱落；4分：肠绒毛消失伴肠坏死。

1.5 统计学方法 应用GraphPad Prism 5统计软件分析数据，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析或非参数检验，两两比较采用LSD-t检验；相关性分析采用Pearson相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外观改变及大便情况 NEC模型+NAC组及NEC模型组新生鼠在造模后出现活动减少、嗜睡，对刺激反应迟钝倦怠，进而可见排黄绿色或黑色稀便。继续给予NAC喂养后，NEC模型+NAC组逐渐出现活动增加，精神恢复，大便颜色逐步转为黄色；而NEC模型组大鼠出现进行性活动减少，拒奶，有两只在第7、10 d死亡，有6只出现肉眼可见黑红色血便。而生理盐水对照组生长发育良好，体重稳定增长，活动度及对刺激反应好；NAC对照组进食及排便正常，与生理盐水对照组比较无显著差异，大便为金黄色颗粒状，无腹胀等。

2.2 肠道组织病理学检查 NEC模型+NAC组肠道较多炎性细胞浸润，少量的肠上皮细胞变性坏死；NEC模型组可见肠上皮细胞大量变性坏死，肌纤维断裂，肠绒毛腺体崩落；NAC对照组及生理盐水对照组无明显的炎性细胞浸润，肠绒毛腺体正常，肠上皮细胞形态正常。

2.3 肠道组织病理学评分 各组大鼠第10 d肠道组织病理学评分，NEC模型组与NAC对照组、生理盐水对照组比较有统计学差异（P＜0.05），也与NEC模型+NAC组比较有统计学差异（P＜0.05），提示NAC可明显改善NEC模型的肠道损伤。见表1。

表1 各组肠道组织病理学评分

2.4 血清抗氧化活性测定 在实验后第5 d及第10 d，NEC模型组血清抗氧化活显著低于NAC对照组、生理盐水对照组（P＜0.05），也显著低于NEC模型+NAC组（P＜0.05），提示NAC可明显提高血清抗氧化活性。见表2。

3 讨论

目前研究表明，多种病因可导致NEC的发生，缺氧和肠道缺血是其中关键的致病机制之一[5]。特别是氧自由基在NEC发病机制中的作用研究已比较深入，其主要通过细胞和线粒体膜的脂质过氧化反应产生作用。新生儿由于不成熟的抗氧化损伤系统和高水平氧自由基产生酶，氧自由基可对肠道系统产生严重氧化诱导损伤[6]。但是这种损伤可以通过自由基清除剂得到改善[7]。

表2 各组血清抗氧化活性测定

NAC是一种含硫的混合物，具有清除自由基功能，可作为细胞内的抗氧化剂，已被用于多种疾病的预防和治疗[8]。研究证实，NAC可减轻氧自由基造成的细胞损伤，通过细胞膜在细胞内脱乙酰基后形成谷胱甘肽的前体，后者是组织抗氧化损伤的重要内源性防御物质。其作用机制可能与间接抑制细胞凋亡关键酶caspase-3的活性有关[9]。目前NAC在临床主要作为痰液的稀释剂，以及对乙酰氨基酚的中毒解毒剂[10]，在新生儿的临床应用鲜见报道。

本研究通过给NEC大鼠模型NAC治疗5 d后，新生鼠活动增加，精神恢复，大便颜色逐步转为黄色。肠道病理学提示肠道缺血减轻，只有少量的肠上皮细胞变性坏死，由此可见，NAC能有效降低NEC大鼠的肠道损伤。进一步测定各组大鼠血清的氧化应激水平，可以看出NAC主要通过抑制氧化应激反应，提高血清SOD、GSH-Px水平好降低MDA水平，达到保护肠道缺血缺氧性损伤。

目前国内有曾用姜黄素治疗NEC大鼠模型的报道，也取得了一定疗效[11]。姜黄素通过降低促炎因子TNF-α及炎性介质COX-2的表达,相对增加抑炎因子IL-10的表达,从而对NEC大鼠具有保护作用。但是NAC具有清除自由基和抗氧化双重作用，减轻缺血导致的氧化应激损伤疗效更加明显。

综上所述，NAC可提高体内抗氧化水平，具有良好的NEC保护作用，能明显减轻肠道损伤。但是NAC是否可在新生儿期长期应用，以及长期应用的疗程和使用方法、副作用等还需进一步明确。

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Protective effects of NAC against necrotizing enterocolitis in neonatal rats

Jiang Yuejuan1,Chen Xia21.Department of Pediatrics,the Second People's Hospital of Zigong,Zigong,Sichuan,643000,China;2. Department of Pediatrics,Hospital 324 of PLA,Chongqing,400020,China

Objective To explore the protective effects of N-acetylcysteine (NAC)against the intestinal injury in SD neonatal rats with necrotizing enterocolitis (NEC)model.MethodsA total of 40 SD rats aged three days were randomly divided into four groups:NEC model group,NAC control group,normal saline group,and NEC model+NAC group(n=10,respectively).NEC models were prepared by means of hypoxia and re-oxygenation cold stimulation for five days.Therefore,except for NEC model group,the other three groups received lavage with NAC(100 mg/time)or normal saline(5 m l/time),once a day for total five days.Five rats in each group were killed on the fifth and tenth day of the experiment respectively.The anatomy of the ileocecal valve in the proximal intestine was conducted for pathological examination.The levels of serum MDA,GSH-PX and SOD were detected via the venous blood.ResultsTwo rats in NEC model groups died in the experiment.No rat died in other groups.The intestinal tissue pathology scores on the 10th day in NEC model+NAC group and NEC group were higher than those in the normal saline control group and NAC control group(P＜0.05).The scores in NEC model+NAC group were lower than those in NEC model group(P＜0.05).On the fifth and tenth day of the experiments,the serum antioxidant activity in NEC model group was much lower than that in NAC control group and normal saline group(P＜0.05),and significantly lower than that in NEC model+NAC group(P＜0.05),indicating that NAC could significantly improve serum antioxidant activity(P＜0.05).ConclusionNAC can mitigate the intestinal histologic injury in NEC rats and increase the antioxidative level,and can provide excellent intestinal protection.

enterocolitis;necrotizing,NAC;antioxidation;rat

R 516.1

A

1004-0188（2016）12-1416-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.018

2015-11-22）

益普生腹泻基金(IDF-2012-04)

643000四川自贡，自贡市第二人民医院儿科（蒋月娟）；解放军324医院儿科（陈 霞）

陈 霞，电话13983202719；E-mail：06chenxia@163. com