小麦糖转运蛋白基因 TaSWEET6的克隆与表达分析

徐 磊，王伟伟，苏世超，马锦绣，孙 辉，房兆峰，高世庆，唐益苗，赵昌平，蒋 涛

(1.首都师范大学生命科学学院，北京 100048； 2.北京市农林科学院北京杂交小麦工程技术研究中心，北京100097)

小麦糖转运蛋白基因 TaSWEET6的克隆与表达分析

徐 磊1，王伟伟2，苏世超2，马锦绣2，孙 辉2，房兆峰2，高世庆2，唐益苗2，赵昌平2，蒋 涛2

(1.首都师范大学生命科学学院，北京 100048； 2.北京市农林科学院北京杂交小麦工程技术研究中心，北京100097)

植物SWEET基因家族是一类糖转运蛋白，参与生殖发育、衰老、逆境响应等多个生理过程。为研究小麦SWEET基因对逆境胁迫的响应及其在花药发育过程中的功能，采用同源克隆的方法从普通六倍体小麦中克隆出 TaSWEET6基因(GenBank登录号为KU936097)后对其进行染色体定位、同源蛋白序列比对和系统进化树分析，同时分析 TaSWEET6基因于普通六倍体小麦在正常生长情况下及非生物胁迫条件下不同组织器官中和光温敏雄性不育小麦BS366在不同发育时期的花药中的表达模式。序列分析结果表明， TaSWEET6基因包含1个732 bp的完整开放阅读框，编码243个氨基酸。跨膜结构分析得知，TaSWEET6蛋白包含2个Mtn3_slv跨膜结构域和1个起连接作用的跨膜-螺旋。系统进化树分析表明，TaSWEET6蛋白与大麦处于同一分支，其亲缘关系最近。中国春缺四体定位表明， TaSWEET6基因位于7D染色体上。表达分析表明， TaSWEET6基因在小麦根、茎、叶、种子、小花(除去雄蕊)、各时期雄蕊中均有表达，小孢子时期雄蕊表达量最高；在低温、干旱、NaCl和ABA胁迫处理下， TaSWEET6基因表达均有上调；光温敏雄性不育系BS366在不育环境(低温短日照)下， TaSWEET6 基因在雄蕊发育关键时期(二分体时期)高度表达。说明小麦 TaSWET6基因可能参与了多种逆境应答反应，并在小麦雄蕊发育过程中发挥着重要作用。

小麦；糖转运蛋白；非生物胁迫；雄性不育

SWEET基因家族编码具有2个MtN3/saliva保守跨膜结构域的糖转运蛋白[1]，因该蛋白作为糖转运载体参与糖的运输被命名为SWEET[2-3]。MtN3结构域最早在苜蓿根部结瘤素中被发现[4]。此后，在动物、植物、细菌等生物中也被相继发现[1]。与其他生物相比，植物中分布的SWEET基因最多，如拟南芥有17个、水稻有21个、高梁有21个[5-6]。研究表明，SWEET基因参与调控糖在韧皮部的长距离离子运输、生殖发育、衰老、生物和非生物胁迫应答等[7]。如拟南芥中 AtSWEET11和 AtSWEET12在韧皮部薄壁组织表达，可以将叶片中的蔗糖转运至维管束中。 AtSWEET11和 AtSWEET12在氨基酸水平上同源度高达88%，各自的T-DNA插入突变体与对照相比较没有明显的形态学表型变化，但 AtSWEET11和 AtSWEET12的双突变体表现为植株矮小，叶片中蔗糖、己糖含量增加，维管束中蔗糖含量减少[8-9]。水稻中， Xa13/Os8N3/OsSWEET11在小花和雄蕊中的表达量远高于其他组织，其转基因沉默植株表现为花粉母细胞在单核花粉期停止发育，并且未成熟的花粉开始退化，导致雄配子育性降低或者高度雄性不育[10]。同时，还发现 Os11N3/OsSWEET14突变体生长延迟和籽粒变小[11]。拟南芥 RPG1/AtSWEET8编码一个花粉母细胞和绒毡层特异表达的蛋白，在花粉外壁外层的形成过程中起重要作用[2,12]。 RPG1/AtSWEET8在胚囊中也表达，可能参与到雌配子发育过程的调节。拟南芥 SAG29/AtSWEET15受低温、高盐和干旱胁迫诱导，其超量表达转基因植株对高盐胁迫高度敏感，并且其根系细胞耐受力减弱[13-14]。抑制 OsSWEET11或 OsSWEET14的表达使水稻白叶枯病菌的抗性提升[10-11]。

小麦是全球最重要的粮食作物之一。然而，关于小麦SWEET基因及其表达调控等目前还未见报道。鉴于此，本研究拟采用同源克隆的方法从普通六倍体小麦中克隆出SWEET基因后对其进行染色体定位、同源蛋白序列比对和系统进化树分析，同时研究其在低温、干旱、高盐和ABA等环境胁迫处理下的组织特异性表达情况及其在小麦雄性不育中的表达调控机制，旨在为进一步研究小麦SWEET基因参与逆境胁迫反应及其在雄性不育中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料及其处理

光温敏雄性不育系BS366及普通六倍体小麦京花9号和扬麦12由本实验室保存，中国春及其缺四体(N7AT7B、N7BT7A、N7DT7B)由中国农业科学院叶兴国研究员提供。

将京花9号的种子置于培养间于25 ℃、16 h·d-1光照水培培养，待幼苗水培生长2周(14 d)后进行干旱(滤纸吸干水，空气中晾干)、高盐(250 mmol·L-1NaCl)、脱落酸(200 mol·L-1ABA)、低温(4 ℃)胁迫处理，然后分别在0、1、2、5、10、24 h后取各处理幼苗叶片，液氮冷冻，-80 ℃保存，用于目的基因的胁迫表达分析。将扬麦12种植于北京海淀田间，根、茎、叶、小花(除雄蕊)取于花药减数分裂前期，雄蕊分别取于减数分裂前(premeiosis stage)、减数分裂时期(meiosis stage)及小孢子期(young microspore stage)，种子取于开花后15 d，液氮冷冻，-80 ℃保存，用于目的基因的组织特异性表达分析。挑选籽粒饱满的中国春及其缺四体小麦种子，水培生长2周(14 d)，取幼苗叶片于液氮冷冻，-80 ℃保存，用于基因染色体定位。光温敏雄性不育系BS366种植于北京(长日照、高温)和安徽阜阳(短日照、低温)田间，待小麦挑旗以后，分别取减数分裂前(premeiosis stage)、二分体时期(dyad stage)、四分体时期(tetrad stage)和小孢子期(young microspore stage)的雄蕊，取材方法参照Tang等[15]的方法，液氮冷冻，-80 ℃保存，用于分析目的基因在可育环境下和不育环境下雄蕊中的表达特性。

1.2 DNA和RNA的提取及cDNA的合成

利用 CTAB 法提取小麦叶片基因组DNA，-20 ℃保存备用。用Trizol法提取小麦不同组织器官及幼苗的总RNA，经 DNase I(Promega，美国)处理后作为模板，以Oligo dT为引物，用 PrimeScriptTMRT reagent Kit(Takara，日本)反转录合成 cDNA，-20 ℃保存备用。

1.3 TaSWEET6基因的克隆

调取NCBI的UNIGENE数据库中Ta.23687的所有EST序列，利用在线工具CAP3(http://doua.prabi.fr/software/cap3)对EST序列进行拼接，将拼接好的序列在Gramene的普通六倍体小麦基因组数据库(IWGSC1.0+popseq)中进行Blastn同源比对分析，然后选取相似度达100%的序列Traes_7DL_015FBEE0C.1设计引物SWEET-cDNA-F/SWEET-cDNA-R(表1)。以扬麦12的小孢子时期雄蕊cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系20 μL，包括2×TransTaqHigh Fidelity PCR SuperMix(Transgen，北京) 10 μL、模板DNA(100 ng· L-1)1 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、ddH2O 7 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。目的片段纯化后克隆到pEASY-Blunt Zero(Transgen,北京) 载体上，经PCR和酶切鉴定后测序(北京六合华大基因公司)。

1.4 TaSWEET6蛋白的生物信息学分析

利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)和TMHMM(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 预测TaSWEET6蛋白的跨膜结构。

以TaSWEET6蛋白序列为目标序列，在Phytozome11 (www.phytozome.jgi.doe.gov/) 和Gramene (www.gramene.org/) 网站搜索，获得粗山羊草 (Aegilopstauschii)、乌拉尔图小麦(Triticumurartu)、大麦(Hordeumvulgare)、短柄草(Brachypodiumdistachyon)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbiocolor)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)的同源蛋白序列，并对以上蛋白序列在Pfam (http://pfam.xfam.org/) 中进行保守结构域分析。运用ClustalW (http:// www.ebi.ac.uk/clustalw/) 以默认参数进行多序列比对分析，使用DNAMAN输出序列比对结果，在MEGA 5.0软件中输出基于neighbor-joining法构建的系统进化树，bootstrap值设置为1 000次重复。

1.5 TaSWEET6基因的染色体定位

运用Primer Premier 5.0软件，结合小麦基因组序列，根据 TaSWEET6基因的基因组序列设计特异性引物SWEET-DNA-F/SWEET-DNA-R(表1)。以中国春及其缺四体DNA为模板进行PCR扩增。扩增体系20 μL， 包括2×TransTaq-T PCR SuperMix(Transgen，北京) 10 μL、模板DNA(100 ng· L-1)1 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、ddH2O 7 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶分离，使用凝胶成像系统(UVP，美国)采集图像。

1.6 TaSWEET6基因的表达分析

根据 TaSWEET6基因cDNA序列设计表达分析所用引物SWEET-qPCR-F/SWEET-qPCR-R(表1)。以小麦Actin基因为内参，以1.2中得到的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。PCR反应体系为20 μL，包括2× SYBR Premix ExTaq10 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL、cDNA模板100 ng，其余用ddH2O补足。PCR扩增于Illumina Eco real-time PCR仪上进行，反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环后增加熔解曲线环节。每次反应作3次生物学重复，并采用2-△△Ct法计算基因相对表达量，同时计算其标准差。

表1 本研究所用引物序列

Table 1 Sequence of primers used in this study

引物名称Primername引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')SWEET-cDNA-FCAACCCACAACCAACCCTTCSWEET-cDNA-RTGCAAGCCAATGCTTATCTGTCCSWEET-DNA-FCCTCTACGTCACGGTCAGTACATACSWEET-DNA-RACGAGGGCAGACGACAGTGGTTCSWEET-qPCR-FCGGTCACCGTGGACAGATAAGCSWEET-qPCR-RGAGGGCAGACGACAGTGGTTCActin-FTACTCCCTCACAACAACCGActin-RAGAACCTCCACTGAGAACAA

2 结果与分析

2.1 TaSWEET6基因的克隆及其编码蛋白的跨膜结构分析

以扬麦12小孢子时期雄蕊的cDNA为模板，利用引物SWEET-cDNA-F/SWEET-cDNA-R进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，得到大小为800 bp左右的单一条带(图1)。将目的片段纯化、克隆并测序后，得到长度为806 bp的序列，开放阅读框为732 bp，编码243个氨基酸。经Blast比较分析，该基因与 OsSWEET6B(LOC_Os01g42090.1)相似，暂命名为 TaSWEET6。利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)和TMHMM分析 TaSWEET6基因所编码的氨基酸序列，发现其含有2个Mtn3_slv跨膜结构域和1个起连接作用的跨膜-螺旋，进一步说明 TaSWEET6基因属于SWEET基因家族。

M：DL2000; 1：扩增产物 Amplified products.

图1 TaSWEET6基因的RT-PCR扩增产物

Fig.1 Amplified products of TaSWEET6 gene by RT-PCR

2.2 TaSWEET6同源蛋白序列的比对及进化分析

将TaSWEET6蛋白序列提交至Phytozome11(https://phytozome.jgi.doe.gov/)和Gramene(http://www.gramene.org/)网站进行Blastp比对，结果发现，其与来源于粗山羊草(EMT16545.1)、乌拉尔图小麦(EMS47629.1)、短柄草(Bradi2g42990.1)、玉米(GRMZM2G 157675)、高粱(Sobic.003G213000.1)、水稻(LOC_Os01g42090.1)、拟南芥(AT5G62850.1)、大麦(MLOC_17346.2)、大豆(GLYMA08G02890.1)的SWEET蛋白序列相似性分别为86%、85%、82%、82%、81%、75%、53%、86%、56%。所有SWEET蛋白均包含2个Mtn3_slv结构域，且位置完全相同(图2A)。利用neighbor joining法构建进化树，结果(图2B)表明，单子叶和双子叶植物SWEET蛋白分别聚为两类，小麦与大麦亲缘关系最近。

2.3 TaSWEET6基因的染色体定位

根据六倍体普通小麦数据库序列信息(Traes_7DL_015FBEE0C.1)，小麦 TaSWEET6基因位于7D染色体上。为了进一步确认其染色体定位信息，利用7D基因组特异性引物SWEET-DNA-F/SWEET-DNA-R对中国春和中国春缺四体材料N7AT7B、N7BT7A、N7DT7B进行扩增，结果(图3)显示，这对引物在中国春与中国春缺四体材料N7AT7B、N7BT7A中均扩增出预期大小的条带，只有N7DT7B中没有扩增出对应的条带，说明小麦 TaSWEET6基因位于7D染色体上。

2.4 TaSWEET6基因的组织特异性表达

利用qRT-PCR对 TaSWEET6基因在扬麦12减数分裂前期不同组织器官及不同发育阶段的花药中的表达模式进行分析，结果(图4)发现，该基因在根、茎、叶、种子、小花(除去雄蕊)、减数分裂前雄蕊、减数分裂时期雄蕊和小孢子期雄蕊中均有表达，而各时期雄蕊中的相对表达量较高，其中，小孢子时期雄蕊表达量最高，大约是根中的35倍。表明该基因在小麦雄蕊中特异性表达。

2.5 逆境胁迫下 TaSWEET6基因的表达

为进一步了解 TaSWEET6基因对逆境胁迫的响应，利用qRT-PCR技术，分析在低温、高盐、干旱和脱落酸(ABA)处理下小麦幼苗中该基因的表达情况。结果表明，该基因对低温胁迫敏感，表达量持续上升，在10h时表达量上升至处理前的44倍，达到最高值，随后表达水平下降，但仍然高于处理前水平(图5A)；在NaCl胁迫处理下，该基因表达量在2 h时达到最高值，大约为处理前表达量的40倍，随后表达水平下降，但表达量仍然维持在一个稳定的水平，约为处理前表达量的20倍(图5B)；干旱处理2 h后，该基因表达量急剧上升至最高，随后表达水平下降(图5C)，表明 TaSWEET6表达受干旱胁迫诱导；在ABA胁迫处理下，该基因表达量稳步上升，在10 h时表达量达到最高值，随后略有下降(图5D)。以上结果表明， TaSWEET6参与这些非生物胁迫应答反应过程。

图2 TaSWEET6与其他9种植物SWEET蛋白的序列比对(A)和系统进化分析(B)

M：DL2000

1:根；2:茎；3:叶；4:小穗(除去雄蕊)；5:种子；6:减数分裂前雄蕊；7:减数分裂时期雄蕊；8:小孢子期雄蕊。

1:Root; 2:Stem; 3:Leaf; 4:Spikelet (remove the anther); 5:Seed; 6:Anther at premeiosis stage; 7:Anther at meiosis stage; 8:Anther at young microspore stage.

图4 TaSWEET6基因在不同组织器官中的相对表达量

Fig.4 Relative expression level of TaSWEET6 gene in different organs of wheat

2.6 TaSWEET6基因在光温敏雄性不育系BS366中的表达

为进一步明确 TaSWEET6基因在小麦雄性不育中的调控机制，利用小麦雄性不育系BS366分析 TaSWEET6基因在可育环境下和不育环境下雄蕊中的表达特性。结果(图6)表明，该基因在不育环境下二分体时期雄蕊中高度表达，约为可育环境下二分体时期雄蕊中表达量的26倍，说明 TaSWEET6基因在可育环境下和不育环境下雄蕊中差异表达。

图5 在4 ℃低温(A)、NaCl(B)、干旱(C)和ABA(D)胁迫下小麦幼苗中 TaSWEET6基因的相对表达量

F1～F4分别表示在可育环境下的减数分裂前、二分体期、四分体期和小孢子期；S1～S4分别表示在不育环境的减数分裂前、二分体期、四分体期和小孢子期。

F1～F4 indicated premeiosis stage,dyad stage,tetrad stage and young microspore stage under fertile condition,respectively; S1～S4 indicated premeiosis stage, dyad stage,tetrad stage and young microspore stage under sterile condition,respectively.

图6 光温敏雄性不育系BS366在可育环境与不育环境下的雄蕊中 TaSWEET6基因的相对表达量

Fig.6 Relative expression level of TaSWEET6 in the anthers of the wheat TGMS line BS366 under fertile and sterile conditions

3 讨 论

SWEET蛋白在植物中广泛存在，且在拟南芥、水稻、短柄草、高粱、玉米等植物中均有报道[7]，但小麦作为世界最大的作物，尚未见SWEET相关基因研究报道。本研究首次通过RT-PCR技术从小麦中克隆获得 TaSWEET6的全长cDNA序列。序列分析表明， TaSWEET6基因所编码的氨基酸序列与水稻、拟南芥等植物SWEET氨基酸序列同源性高，且含有2个Mtn3_slv保守结构域，属于SWEET基因家族。

在众多植物中，MtN3/saliva/SWEET类基因对非生物胁迫均有响应。可溶性糖是植物不可或缺的组分，SWEET作为糖转运载体参与糖的运输，被运输到植物不同的组织和细胞器中[16]。在胁迫环境下，植物体内糖含量会明显增加，以此来降低体内渗透势，有利于植物在逆境下维持正常生长，提高了植物抗逆能力[17]。拟南芥 AtSWEET17基因的突变体植株在低温或低氮胁迫下，对比野生型植株叶片中的果糖含量增加。 AtSWEET17在叶和根系的液泡中均有表达，过表达 AtSWEET17在低温胁迫下叶片中的果糖减少[18-21]。 AtSWEET16和 AtSWEET17是同源基因，在低温或低氮胁迫下均能引起 AtSWEET16表达下调， AtSWEET16超量表达植株表现出更高的发芽率和耐寒性增强， AtSWEET16可以促进蔗糖、葡萄糖和果糖的转运，其超量表达植株在糖水平上有显著的改变[22]。在低温、高盐、干旱和ABA等逆境胁迫条件下， TaSWEET6被强烈诱导上调表达，推测可能参与ABA相关抗逆信号传导网络途径，但该基因是否参与调节果糖、葡萄糖等的运输还需要进一步研究。

大量研究表明，植物SWEET基因表达具有花组织特异性且参与植物生殖发育过程。如拟南芥中 RPG1/AtSWEET8和 RPG2/AtSWEET13在花药中特异表达，并且参与花粉壁外层形成[13-23]；拟南芥 RPG1/SWEET8和 RPG2/SWEET13均在雄蕊中特异性表达，参与到花粉原外壁沉积和花粉壁外层形成过程，并且 rpg1rpg2双突变体表现为不育。如水稻SWEET基因 OsSWEET2a、OsSWEET1a、OsSWEET4、OsSWEET15、OsSWEET3a、OsSWEET5 和 OsSWEET11在不同发育阶段的小花中高度表达[16,24-25]。水稻 OsSWEET11在花药中高度表达，其RNAi转基因植株表现为未成熟花粉发育停滞并且逐渐退化，导致雄性不育[3,10]。本研究发现，小麦 TaSWEET6在不同发育阶段的雄蕊(减数分裂前期、减数分裂期、小孢子期)中表达量均高于其他组织，且在小孢子时期雄蕊中表达量最高，推测该基因可能参与小麦雄蕊发育过程。

杂种优势利用被认为是今后小麦生产水平大幅度提高的主要途径之一。小麦光温敏雄性不育系是由光、温环境因素诱导育性基因及其网络表达的控制，花粉败育是雄性不育基因表达的最终结果。小麦光温敏雄性不育系BS366在长日照、高温表现为雄性可育，短日照、低温表现为雄性不育的特性。唐忠辉等[15]报道小麦光温敏雄性不育系BS366在低温处理下(即不育环境)，其雄蕊细胞质分裂异常，不能形成正常的二分体；在正常生长条件下(即可育环境)雄蕊细胞质分裂正常，形成二分体。本研究发现， TaSWEET6在光温敏雄性不育系BS366不育环境下的雄蕊中，在二分体时期表达达到最高，比可育环境下相应时期的表达提高。因此，小麦 TaSWEET6基因可能在雄蕊发育过程中起到重要作用。

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Cloning and Expression Analysis of a Sugar Transporter Protein Gene TaSWEET6 in Wheat

XU Lei1,WANG Weiwei2,SU Shichao2,MA Jinxiu2,SUN Hui2,FANG Zhaofeng2,GAO Shiqing2,TANG Yimiao2,ZHAO Changping2，JIANG Tao2

(1.College of Life Sciences,Capital Normal University,Beijing 100048,China; 2.Hybrid Technology Engineering Research Center of Wheat,Beijing Academy of Agriculture and Forestry,Beijing 100097,China)

SWEET family is a sugar transporter protein family in plants,which are involved in multiple physiological processes,including reproductive development,senescence,and abiotic stress responses. Our objectives are to analyse the expression of TaSWEET6 under various abiotic stresses and how TaSWEET6 influences the development of anther. To understand the function of TaSWEET6,qRT-PCR assays were used to quantify the expression of TaSWEET6 within different wheat organs. The expression of TaSWEET6 in anther of a photoperiod-thermos-sensitive genic male sterility line BS366 at different developmental stages under various abiotic stresses was quantified by qRT-PCR. We cloned a full-length cDNA sequence of TaSWEET6 (GenBank Accession No. KU936097) from wheat by RT-PCR,which has 806 bp in length containing a 732 bp ORF (open reading frame),encoding 243 amino acid residues. The phylogenetic analysis of TaSWEET6 indicated high similarity with the SWEET protein in barley. The chromosome localization of TaSWEET6 was confirmed by nullisomic-tetrasomic (NT) analysis,which was detected to be located on chromosome 7D in wheat.TaSWEET6 protein contains two Mnt3_slv transmembrane domains that are connected by an inversion linker helix using TMHMM tool. Expression of TaSWEET6 have been observed in different tissues of wheat organs such as root,stem,leaf,spikelet (except anther),and anther at different stages,while TaSWEET6 preferentially expressed in the young anther at microspore stage. The qRT-PCR assays detected that TaSWEET6 was up-regulated by low temperature at 4 ℃,drought,NaCl and ABA treatments. The high expression of TaSWEET6 was detected in anther of BS366 at dyad stage under sterile condition (low temperature and short day). These results provide basic information for the functional analysis of TaSWEET6 in response to various stresses,and also suggest that TaSWEET6 play a critical role in the process of wheat anther development.

Wheat; Sugar transporter; Abiotic stress; Male sterility

时间：2016-11-04

2016-04-25

2016-10-18

国家转基因重大专项(2016ZX08002-003)；北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX20140202)；国家自然科学基金项目(31371699)；北京自然科学基金项目(5131001)；北京市科技计划项目(Z141100002314018)

E-mail:xulei_hello@163.com(徐 磊)；wangweiwei2398@126.com(王伟伟，与第一作者同等贡献)

赵昌平(E-mail:cp_zhao@vip.sohu.com)；唐益苗(E-mail:tangyimiao@126.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)11-1411-08

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161104.0924.012.html