冬小麦 miR398前体的克隆及其在低温条件下对靶基因 CSD1表达的调控

梅 琳，徐庆华，苍 晶，卢秋巍，于 晶，张 达，冯明芳，张舒驰，梁桂花，张 超

(东北农业大学生命科学学院植物生理与分子生物学研究室，黑龙江哈尔滨 150030)

冬小麦 miR398前体的克隆及其在低温条件下对靶基因 CSD1表达的调控

梅 琳，徐庆华，苍 晶，卢秋巍，于 晶，张 达，冯明芳，张舒驰，梁桂花，张 超

(东北农业大学生命科学学院植物生理与分子生物学研究室，黑龙江哈尔滨 150030)

miR398是受逆境胁迫负调控的miRNA，其靶基因CSD编码超氧化物歧化酶(SOD)，使植物抵御活性氧(ROS)的毒害。为进一步了解低温胁迫下 miR398的调控机制，从东农冬麦1号中克隆小麦 miR398前体，构建过表达载体并转化拟南芥，用Real-time PCR检测T0代植株中小麦 miR398及其靶基因 CSD1在低温胁迫下的表达量。结果表明，随着低温胁迫时间的延长， miR398表达下调、 CSD1基因表达上调，认为小麦 miR398能响应低温胁迫、负调控 CSD1基因表达，间接提高了拟南芥的抗寒性。

冬小麦； miR398； CSD1；抗寒性；表达调控

MicroRNAs(miRNAs)是一种重要的调控因子，在植物逆境胁迫中发挥重要作用[1]。在低温胁迫下，miRNA不仅调控其靶基因，部分miRNA也直接参与了植物逆境胁迫应答[2-3]。miRNA的调控机制取决于其与靶基因的碱基互补配对程度，如果miRNA与靶基因完全匹配，则该复合体降解mRNA；若两者序列部分匹配，则通过抑制靶基因的翻译来沉默特定基因[4]。

miR398参与植物逆境应答[5]，并且在水稻和拟南芥中高度保守，暗示其可能在多种生物胁迫下都发挥调控作用[6]。已有研究表明， miR398是通过对其靶基因CSD(编码Cu-Zn型超氧化物歧化酶)的剪切实现负向调控[7]。 miR398的靶基因CSD包括两种类型，分别为细胞质 CSD1和叶绿体 CSD2[6]。已有相关研究报道， CSD1参与氧化应激、铜离子、盐胁迫以及细菌感染等胁迫过程的应答，能够一定程度消除胁迫中产生的活性氧[8]。过表达抗 miR398的 CSD2转基因拟南芥植株中， CSD2的高表达会比正常情况下 CSD2的表达产生更多的 CSD2 mRNA，进而提高植株对高光强、重金属等逆境的抵抗力[9]。目前对 miR398与其靶基因的研究主要集中在拟南芥、烟草等植物中，而在冬小麦中鲜有报道。

东北农业大学自主培育的东农冬麦1号(Dongnongdongmai 1，简写为DN1)是首例能在黑龙江省高寒地区越冬(返青率85%以上)的强抗寒(可耐-30 ℃低温)栽培品种。本研究室应用Hiseq高通量技术构建了DN1在5 ℃、-10 ℃和-25 ℃低温胁迫下的miRNA库，对其分析表明 miR398在5 ℃时表达量微弱，在-10 ℃时表达量升高，在-25 ℃时表达量最高[10]，但对低温胁迫调控 miR398表达的分子机制尚不清楚[11]。为了明确 miR398与低温胁迫的关系，需要利用生物信息学和生物学试验等方法寻找miRNA的靶基因[12]，并探索低温下 miR398与靶基因的作用关系。植物中miRNA与靶基因之间几乎是完全互补配对[4]，利用生物信息学筛选靶基因不仅可获得大量候选靶基因，而且准确率较高[13]。鉴于此，本研究以DN1为材料，克隆小麦 miR398前体( pre-tae-miR398)，在利用生物信息学方法筛选小麦 miR398靶基因的基础上，进一步转化拟南芥，检测转基因拟南芥植株中 miR398及其靶基因在低温胁迫下的表达调控，初步明确DN1中 miR398与低温胁迫的关系，以期为揭示miRNA调控DN1强抗寒性的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

强抗寒冬小麦品种DN1(东农冬麦1号)由东北农业大学小麦育种实验室惠赠。拟南芥(ArabidopsisthalianaL.) Col(Columbia)生态型由东北农业大学植物生理与分子实验室提供。引物合成和测序均由哈尔滨博仕生物技术有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 冬小麦总DNA的提取

采用CTAB法提取DN1的分蘖节总DNA，用RNase I处理纯化DNA。

1.2.2 pre-tae-miR398的PCR扩增及过表达载体的构建

根据实验室前期获得的冬小麦 miR398的前体序列[10]，应用Primer Premier 5.0设计引物P1/P2(表1)。以1.2.1中提取的总DNA为模板，以P1/P2为引物进行PCR扩增，结果发现，所扩增条带特异性强，且与预期目的条带大小一致，因此，在P1和P2引物的5′端分别加上含PacI酶切位点的特定序列ggcttaaU，重新合成引物P3/P4(表1)。以1.2.1中提取的总DNA为模板，以P3/P4为引物进行PCR扩增，扩增产物用USERTM酶消化。参照Nour-Eldin等的方法[14]，采用Nt.BbvCI和PacI双酶切质粒pCAMBIA3300(携带CaMV35s启动子)，酶切后的质粒也用USERTM酶消化。然后，将USERTM酶消化后的PCR扩增产物和质粒经回收、纯化后进行连接，获得过表达载体pCAMBIA330035sU- pre-tae-miR398。最后，将过表达载体转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌株，提取质粒后测序鉴定。

PCR扩增体系为20 μL,包括10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTPs 1.6 μL、DNA模板0.8 μL、引物P3和P4各0.7 μL、1 U·μL-1Taq酶0.1 μL、ddH2O 14.1 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

酶切体系为100 μL，包括NEB4 10 μL、10×BSA 10 μL、pCAMBIA3300载体20 μL、ddH2O 58 μL、PacI和Nt.BbvCI各1 μL。酶切反应条件：PacI加入后37 ℃反应1 h，再加入Nt.BbvCI于37 ℃反应1 h。酶切反应结束后，将产物于-20 ℃保存备用。

1.2.3 农杆菌侵入法转化拟南芥及其低温胁迫培养

将测序鉴定正确的pCAMBIA330035sU- pre-tae-miR398质粒转化农杆菌EHA105，挑取阳性克隆，菌落PCR鉴定。农杆菌侵染拟南芥参照邱 礽等[16]的方法。野生型与转化后的拟南芥置于4 ℃培养箱中，并分别于0、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h 后取叶片，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.2.4 Real-time PCR

按照Trizol说明书中的方法提取拟南芥叶片的总RNA (宝生物工程有限公司，大连)。反转录总RNA (包含小RNA)用miRNA cDNA synthesis kit及Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(宝生物工程有限公司，大连)试剂盒，并按照操作说明进行。Real-time PCR利用STBR试剂盒(宝生物工程有限公司，大连)。miRNA的内参基因为 U6，靶基因的内参基因为Actin，对反转录产物cDNA样品进行归一化，用2-△△Ct法分析。每个样品做3个生物重复，每个反应各设一个空白对照(cDNA模板空白)。各内参基因引物见表1。

表1 本研究所用引物序列

Table 1 Primer sequences used in this study

引物名称 Primername引物序列(5'-3') Primersequence(5'-3')P1AGACGCGAGGAAATTCCTGP2GCGAGGAGGCTCCAGCP3GGCTTAAUAGACGCGAGGAAATTCCTGP4GGCTTAAUGCGAGGAGGCTCCAGCP5ACACTCCAGCTGGGTGTGTTCTCAGGTCGP6CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGGGGGCG反向通用引物ReverseuniversalprimerTGGTGTCGTGGAGTCGU6-FATTGGAACGATACAGAGAAGATTU6-RGGAACGCTTCACGAATTTGP7TTCCGCCCAAGTCCGGATACGCP8GGTGGTCGGGCCATCTCCCTCGTGGGTActin-FCCTTAGTACCTTCCAACAGATGTActin-RCCAGACAACTCGCAACTTAGA

1.2.5 生物信息学分析

利用miRNA在线数据库miRBase (http://www.mirbase.org/search.shtml)筛选小麦miRNA。利用RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)分析miRNA的二级结构。利用psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNA-Target/)、PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)和Targetscan (http://genes.mit.edu/mirscan/)预测靶基因。

2 结果与分析

2.1 pre-tae-miR398的克隆及 miR398的靶基因预测结果

经过比对发现，实验室前期建立的DN1小RNA数据库(未发表)中 miR398的前体序列与miRNA在线数据库miRBase登录的序列(MIPF0000107)一致。利用RNAfold预测 miR398的前体序列二级结构，结果表明，其能够形成miRNA特有的颈环结构(图1)。

利用引物P3/P4对DN1的总DNA进行PCR扩增，扩增产物经4%琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约120 bp的单一条带，且与预期目的片段大小一致(图2)。将经过酶切等处理的目的片段和pCAMBIA3300载体进行连接，转化到大肠杆菌DH5α中，并从中随机挑取8个阳性克隆提取质粒，送博仕生物测序。测序结果与小RNA数据库中 pre-tae-miR398序列的碱基序列同源性为100%，即获得了pCAMBIA330035sU- pre-tae-miR398重组质粒。通过三个靶基因预测软件分析对比，参数均设为默认值，筛选出匹配度相对较高的靶基因，并通过NCBI检索确定 miR398的靶基因为 CSD1(DR735568)。

图1 DN1中 miR398前体的二级结构

M:DL 20 bp DNA marker; 1: pre-tae-miR398的扩增产物。

M:DL 20 bp DNA marker;1:Amplified products of wheat precursor gene ofmiR398.

图2 DN1中 pre-tae-miR398的PCR扩增结果

Fig.2 PCR product of wheat precursor gene ofmiR398 of DN1

2.2 过表达载体转化拟南芥及 miR398与其靶基因引物的验证结果

提取的pCAMBIA330035sU-pre-tae-miR398转入农杆菌，随机挑取单菌落进行PCR，引物为P1/P2(表1)，用4%的琼脂糖凝胶电泳得到阳性克隆产物(图3)，并选取长势一致的拟南芥进行侵染。根据miRNA特有的颈环结构与其靶基因序列分别设计引物P5/P6和P7/P8(表1)，验证引物的特异性。以DN1的cDNA为模板，4%琼脂糖凝胶电泳检测，发现在80 bp处有一清晰的条带，与预测的 miR398颈环法反转录扩增大小一致(图4A)，其靶基因也与预测的125 bp大小一致(图4B)。

M:DL 20 bp DNA marker; 1～3:菌落PCR扩增产物; CK:阴性对照。

M:DL 20 bp DNA marker; 1～3:Colony PCR amplification products; CK:Negative control.

图3 重组质粒导入农杆菌后的菌落PCR检测结果

Fig.3 PCR analysis of recombinant plasmid

M:DL 20 bp DNA marker; 1: miR398引物的验证; 2:靶基因引物的验证。

M:DL 20 bp DNA marker; 1:Validation of miR398 primers; 2:Validation of target gene primers.

图4 miR398(A)及其靶基因(B)引物的特异性检测结果

Fig.4 Specific detection of miR398 (A) and its target gene (B) primers

2.3 低温胁迫下T0代 miR398前体转化拟南芥植株的 miR398及 CSD1基因的表达

对野生型与转化后的拟南芥植株进行4 ℃低温胁迫，并检测内源及外源 miR398及靶基因的表达情况，结果表明， pre-tae-miR398在CAM35S启动子驱动下在拟南芥中过量表达，且与靶基因随低温胁迫表现出规律性变化(图5)。

以未转化的野生型拟南芥作为阳性对照，0 h侵染为阴性对照，4 ℃处理不同时间后， miR398相对表达量表现为先上升后下降(4 h除外)，并在12 h时达到峰值；其对应的靶基因 CSD1在0～4 h 范围内的表达量逐渐升高，在6～24 h范围内的表达量与阴性对照相比逐渐降低，并都显著低于 miR398的表达量，且于12 h表达量最低。12 h后随着 miR398表达量的降低，其靶基因表达量逐渐升高， miR398在48 h表达量再次达到最低，而其靶基因 CSD1则达到峰值，表明 miR398对其靶基因 CSD1呈负调控。

图5 野生型及过表达 pre-tae-miR398植株的 miR398(A)及其靶基因(B)在4 ℃下的相对表达量

3 讨 论

miR398是首个被报道的能够响应多种胁迫的miRNA[6]，在调节植物铜代谢平衡、应答过量的重金属胁迫以及臭氧、盐害等非生物胁迫方面发挥作用。当植物遭遇非生物胁迫时，为了保护膜组织免受伤害，体内的SOD(超氧化物岐化酶)升高达到清除过量ROS的目的[17]。根据辅因子的不同，SOD分为Mn-SOD(MSD)、Cu/Zn-SOD(CSD)和Fe-SOD(FSD)三种类型，其中，CSD作为主要的SOD，在清除ROS的过程中发挥重要作用[18]。低温和干旱胁迫对小麦CSD基因的表达影响不同。小麦MSD基因的表达受低温和干旱诱导，但小麦CSD基因的表达只受低温诱导[19]。苏 群等[20]研究了外源SOD模拟物聚天冬氨酸钾盐(PASPK)对小油菜抗寒性的作用效果，结果表明，低温胁迫下，外源SOD模拟物能够促进小油菜种子的萌发并明显增强幼苗的抗寒性。转豌豆叶绿体CSD在烟草中的过量表达可以提高植株对强光与低温的耐受力[21]。

当植物受到各种生物及非生物胁迫时， CSD1与 miR398始终表现出动态的负调控关系[6]。但在拟南芥中 CSD2表达量在重金属、甲基紫精和强光照的胁迫下增加[22]，而在臭氧和病菌的感染胁迫下减少[23]。Dugas等[24]发现了 miR398与靶基因新的调控机制，蔗糖能够正调控 miR398的表达，并导致 CSD1与 CSD2基因的mRNA转录水平和蛋白质水平降低，这表明不同胁迫刺激的 miR398表达不同，其参与逆境胁迫的机制十分复杂。

本研究表明，4 ℃冷处理下，在野生型与过表达 miR398拟南芥植株中，随着低温胁迫时间的增长， miR398表达量逐渐升高之后降低，其靶基因 CSD1出现与之相反的表达模式，处理4 h时 miR398表达量降低，靶基因 CDS1表达量升高，这可能与植物体对低温信号识别、转导、信号级联放大、响应等一系列过程中存在某一特定应激节点有关，4 h即是过表达植株快速应答低温胁迫的应激节点。吴绍华等[25]在研究抗冷基因 HbMKK6时，在4 ℃处理抗寒品种橡胶树4 h时， HbMKK6表达量最高。在低温处理24 h后，由于过表达 miR398可以增加植物对环境胁迫的灵敏度[26]，使其抗低温胁迫，调节体内相应的生理生化功能，导致 CSD1表达上调。 CSD1的大量积累，可通过调节膜透性、增强膜结构和功能的稳定性，使植物细胞减少损伤，降低ROS对植物造成的伤害，此时 CDS1表达量呈峰值。但随着低温胁迫的延长，在低温胁迫72 h后， CSD1的表达量下降，可能是由于植物有高度复杂的抗氧化系统和响应低温胁迫通路的共同作用，使体内其他防御系统发挥作用[27]，也可能是由于随着低温胁迫时间的增加，植物体受到的损害加剧，导致 CSD1 表达量的再次下降[28]。

从试验结果推测，在低温胁迫下，过表达 pre-tae-miR398植株通过负调控靶基因 CDS1来提高植物的抗寒性,与王健飞等[29]关于DN1低温胁迫下miRNA表达模式的研究结果一致。可以根据 miR398与 CSD1呈负调控关系，对DN1中 miR398进行沉默或者敲除，解除 miR398对靶基因的抑制提高植物的抗寒性。

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Cloning of Winter Wheat Pre- miR398 and Expression Analysis of Target Gene CSD1 under Cold Stress

MEI Lin,XU Qinghua,CANG Jing,LU Qiuwei,YU Jing,ZHANG Da,FENG Mingfang,ZHANG Shuchi,LIANG Guihua,ZHANG Chao

(Laboratory of Plant Physiology and Molecular Biology,School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang 150030,China)

miR398 is a miRNA that is negatively regulated by the adversity. The target geneCSDencoding superoxide dismutase (SOD) can resist the toxicity of ROS in plants. In order to further understand the regulatory mechanism of miR398 under low temperature stress,the wheat miR398 precursor gene was cloned from Dongnongdongmai 1,and overexpression vector was conducted and transformed intoArabidopsisthaliana,and Real-time PCR was used to detect the expression level of miR398 and its target gene CSD1 in T0generation under cold stress.The results showed that miR398 of wheat responded to cold stress and down-regulated the expression of CSD1 inArabidopsis.With the extension of low temperature stress time,the expression of miR398 was down-regulated and the expression of CSD1 was up-regulated. It was suggested that the wheat miR398 could respond to low temperature stress and negatively regulate CSD1 gene expression,which indirectly enhanced the cold resistance ofArabidopsisthaliana.

Winter wheat; miR398; CSD1; Cold resistance; Gene expression regulation

时间：2016-11-04

2016-05-20

2016-10-17

黑龙江省自然科学基金项目(C201418)；东北农业大学科学研究基金项目(2012RCB102)；国家自然科学基金项目(31471423)；国家自然科学基金人才培养科研训练项目(J1210069)；国家自然科学基金人才培养条件建设项目(J1120002)；黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12541002)

E-mail:283862466@qq.com

苍 晶(E-mail:cangjing2003@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)11-1419-07

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161104.0924.002.html