α-酸糖蛋白手性柱对56种手性化合物的拆分

张紫恒，杨 娜，胡 聪，杜 洋，袁黎明

(云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)



α-酸糖蛋白手性柱对56种手性化合物的拆分

张紫恒，杨 娜，胡 聪，杜 洋，袁黎明*

(云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)

采用α-酸糖蛋白手性固定相(Chiral-AGP)，固定流动相pH、流速，化合物样品浓度，考察酸性、碱性、中性手性化合物和21个氨基酸在α-酸糖蛋白手性柱上的拆分情况.应用高效液相色谱法，α-酸糖蛋白手性柱对上述手性样品拆分，一共有8个中性化合物、3个碱性化合物、6个酸性化合物和5个氨基酸得到手性对映分离.探讨了α-酸糖蛋白手性柱对酸性、中性、碱性样品的拆分能力并进行对比，结果证明α-酸糖蛋白手性柱拆分中性化合物和酸性化合物效果最好，拆分碱性化合物和氨基酸效果不好，为α-酸糖蛋白手性柱适合于拆分哪一类型的手性化合物提供参考.

α-酸糖蛋白；手性拆分；液相色谱；手性化合物

手性(chirality)一词，来源于希腊语中的“cheir”,是指物体与它的镜像互不重叠的现象，是人类赖以存在的自然界的本质属性之一[1].目前最广泛采用的手性分析技术是高效液相色谱(HPLC),其可分为手性固定相法、手性试剂衍生化法和手性流动相添加剂法.手性固定相法因其简单、快速和准确的优点,已成为分析和分离对映体的最重要的方法[2-4].由于手性化合物存在着对映异构分子之间具有不同的光学性能和生物活性，其拆分在药学和生物学等领域具有十分重要的意义[5].酸糖蛋白手性柱(Chiral-AGP)因其α-酸糖蛋白(AGP)是一种非常稳定的蛋白质，它不但能耐高浓度的有机溶剂，也耐高温以及较高或较低的pH，用途十分广泛，是所有手性柱中应用范围最广的，可以分离所有类型化合物，胺(伯、仲、叔、季胺)、酸(强和弱)、非光解质(酰胺，酯，醇，亚砜等)[6-7].本研究通过考察不同种类的手性化合物应用高效液相色谱在Chiral-AGP上的拆分效果，确定其在哪种类型的手性化合物上有更优越的拆分效果，为使用Chiral-AGP的实验员提供更好的选择.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

大连依利特液相色谱仪(伊利特分析仪器有限公司，大连)配有P230Ⅱ型高压恒流泵和UV230Ⅱ型紫外-可见检测器，仪器控制和数据采集EC-2006液相色谱工作站，手性色谱柱酸糖蛋白手性柱(Chiral-AGP)购于大赛璐有限公司；手性化合物和氨基酸购于Fluka和Sigma公司，乙酸铵、乙酸均为分析纯购于天津市风船化学试剂科技有限公司，甲醇、异丙醇为进口色谱纯试剂，其余试剂为国产分析纯.

1.2 色谱条件

色谱柱:Chiral-AGP柱(150 mm×4.6 mm,性质稳定的α-酸糖蛋白牢固地键合到粒径为5μm的球形硅胶上的手性固定相)；流动相： 0.01 mol/L乙酸铵(pH=5.8)∶2-丙醇=95∶5(体积比，下同)，柱温：室温，流动相流速：0.9 mL/min，压力上线：140 kg/cm2，检测波长200、254 nm.流动相使用前用0.45 μm滤膜过滤，并经超声波脱气.以1,3,5三叔丁基苯为溶质，测定死时间.

1.3 样品和流动相的制备

样品制备：35种液相手性样品溶于纯色谱纯甲醇，21种氨基酸溶于高纯水，浓度均为1 g/L.

流动相制备：首先配制0.01 mol/L乙酸铵，用乙酸调节其pH为5.8，再按照流动相所需比例制备，使用前用0.45 μm滤膜过滤，然后超声脱泡.

2 结果与讨论

2.1 酸糖蛋白手性柱对中性手性化合物的拆分性能

手性柱：Chiral-AGP柱，0.01 mol/L乙酸铵缓冲液(pH=5.8)-异丙醇(95∶5)为流动相，流速为0.9 mL/min，检测波长254 nm，柱温为25 ℃，进样量5 μL，此条件下拆分15个中性手性化合物，其中有8个手性化合物得到了很好的拆分效果，分别是3号、5号、6号、7号、8号、10号、13号、14号.具体拆分结果见图1及表1.

图1 8个中性化合物在Chiral-AGP柱上的拆分谱图

Table 1 Results of resolution for 15 neutral chiral compounds on Chiral-AGP column

序号中性手性化合物保留因子(κ'1)分离因子(α)分离度(Rs)1号氧氟沙星9.57--2号1-(9-蒽基)-2,2,2-三氟乙醇---3号1-(1-萘基)-乙醇4.651.562.194号1,1'-联-2-萘酚---5号1,2-二苯基乙二醇0.801.491.616号联糠醛0.321.551.077号1,2-二苯乙醇酮2.651.191.258号二氢黄酮12.231.451.089号反-1,2-二苯环氧乙烷9.85--10号特罗格尔碱4.481.440.6711号3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)甲苯酰胺4.07--12号华法林---13号吡喹酮3.201.230.7514号奥美拉唑0.80--15号1-对氯苯基-乙醇0.74--

2.2 酸糖蛋白手性柱对碱性手性化合物的拆分性能

色谱条件：同3.1.拆分12个碱性手性化合物，有3个手性化合物得到较好的拆分效果，分别是17号、21号和22号.具体拆分结果见图2及表2.

图2 3个碱性化合物在Chiral-AGP柱上的拆分谱图

表2Chiral-AGP柱对12个碱性手性化合物的拆分结果

Table2Chiral-AGPcolumnof11basicchiralcompoundssplitresults

序号碱性手性化合物保留因子(κ'1)分离因子(α)分离度(Rs)16号马来酸氯苯那敏4.01--17号盐酸普萘洛尔11.211.130.8418号阿替洛尔0.71--19号美托洛尔0.87--20号沙丁胺醇---21号氨氯地平18.231.200.5422号盐酸克伦特罗3.141.392.1923号硫酸特布他林1.87--24号肾上腺素1.34--25号2-氨基-1-丁醇---26号四咪唑1.78--27号佐匹克隆---

2.3 酸糖蛋白手性柱对酸性手性化合物的拆分性能

色谱条件：同3.1.此条件下拆分8个酸性手性化合物，其中有6个手性化合物得到了很好的拆分效果，分别是28号、30号、31号、32号、33号和35号.具体拆分结果见图3及表3.

图3 6个酸性化合物在Chiral-AGP柱上的拆分谱图

Table 3 Resolution results of eight acidic chiral compounds on Chiral-AGP column

序号酸性手性化合物保留因子(κ'1)分离因子(α)分离度(Rs)28号DL-扁桃酸0.024.350.3929号DNB-亮氨酸0.30--30号布洛芬1.291.230.4231号酮洛芬2.931.371.0232号萘普生3.631.250.9533号氟比洛芬6.701.341.3834号西替利嗪12.34--35号马来酸噻吗咯尔0.0528.085.69

2.4 酸糖蛋白手性柱对氨基酸手性化合物的拆分性能

色谱条件：检测波长为200nm，其他条件同3.1.此条件下拆分21个氨基酸，其中有5个得到了一定的拆分效果，分别是谷氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和缬氨酸，具体拆分结果见图4及表4.

图4 5个氨基酸化合物在Chiral-AGP柱上的拆分谱图

Table4Resolutionresultsof21aminoacidonChiral-AGPcolumn

氨基酸手性化合物保留因子(κ'1)分离因子(α)分离度(Rs)DL-丙氨酸0.0848.887.23DL-缬氨酸0.17--DL-亮氨酸0.03--DL-异亮氨酸0.02--DL-脯氨酸0.05--DL-苯丙氨酸0.04--DL-色氨酸0.50--DL-酪氨酸0.10--DL-对羟基苯甘氨酸0.24--DL-苯甘氨酸0.26--DL-丝氨酸0.059.41.21DL-苏氨酸0.116.551.01DL-半胱氨酸0.26--DL-甲硫氨酸0.18--DL-天冬酰胺0.14--DL-谷酰胺0.082.750.61DL-天冬氨酸0.062.410.56DL-谷氨酸0.09--DL-赖氨酸---DL-精氨酸0.86--DL-组氨酸0.92--

2.5 讨论

Chiral-AGP手性柱在高效液相色谱分离分析中具有广泛应用且适用于所有手性化合物的对映体分离，包括：胺类化合物、酸性化合物和非质子化合物.本实验中主要考察了Chiral-AGP手性柱对中性化合物、碱性化合物，酸性化合物以及氨基酸手性样品的手性分离情况.结果表明，在高效液相色谱检测中，Chiral-AGP手性色谱柱对酸性、碱性、中性手性化合物以及氨基酸中都有拆分效果，其中Chiral-AGP手性柱对15中性化合物拆分，有8个手性化合物得到较好的拆分效果；对8个酸性化合物拆分，有6个手性化合物得到较好拆分效果；对12个碱性化合物拆分，有3个手性化合物得到较好拆分效果；对21个氨基酸拆分，有5个氨基酸得到一定的拆分效果.由于Chiral-AGP手性固定相是α-酸糖蛋白，在酸性条件下比较稳定，在流动相为酸性(pH=5.8)并添加一定量的缓冲溶液的情况下，根据“三点作用”经典手性识别理论，酸性化合物与中性化合物对映体更容易与α-酸糖蛋白发生可逆相互作用，根据形成缔合物的难易程度和稳定程度使得另一对映体优先洗脱，经过多次平衡之后，达到对映体的分离.同时在酸性流动相环境下，碱性化合物和氨基酸与流动相的H+、缓冲液产生某些弱相互作用力，与固定相比较难产生一定的吸附作用力，因此碱性化合物和氨基酸并不能够容易地在Chiral-AGP手性柱上得到理想的拆分效果.因此，Chiral-AGP手性柱在拆分中性和酸性化合物呈现出优异的对映体分离效果；在分离碱性手性化合物和氨基酸时效果不太好.因此，中性及酸性化合物可以选择用Chiral-AGP手性柱拆分，碱性化合物和氨基酸可以选择其他对此类化合物有更好的拆分性能的商品柱进行拆分.

3 结论

选择色谱条件：流动相乙酸铵缓冲液(pH=5.8)-异丙醇，流速0.9 mL/min，检测波长254 nm，柱温为25 ℃，进样量5 μL，用Chiral-AGP手性柱拆分56种手性化合物，结果发现有22种手性化合物得到较好的手性拆分，充分证明了商品Chiral-AGP手性柱是一种优秀的手性柱.从试验结果可以得出该商品柱在弱酸性环境下能够更好地拆分酸性及中性手性化合物.

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[2] YUAN L M.Preretive chromatography technology and application [M].BeiJing: Chemical Industry Press.2005, 92: 184-188.

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[责任编辑：吴文鹏]

Enantiomeric separation of 56 racemates by HPLC usingα-acid glycoprotein chiral stationary phase

ZHANG Ziheng, YANG Na, HU Cong, DU Yang, YUAN Liming*

(CollegeofChemistryandChemicalEngineering,YunnanNormalUniversity,Kunming650500,Yunnan,China)

Fixed pH, velocity and compounds’ concentration of mobile phase, enantiomeric separation of acid, alkali, neutral chiral compounds and 21 amino acids was explored by HPLC using Chiral-AGP.A total of eight neutral compounds, three basic compounds, six acidic compounds and five amino acids had been enantiomeric separated applying HPLC, usingα-Acid Glycoprotein chiral stationary phase.The capability of Chiral-AGP to chiral resolution of acid, alkali, neutral chiral compounds was investigated.The results proved that the acid and neutral compounds can be used in the best resolution, however, the effect of resolution is poor for alkali and amino acids.This paper offers a reference for the apphication of chiral AGP to separate chiral compounds.

α-acid glycoprotein; chiral separation; liquid chromatography; chiral compounds

2016-07-26.

国家自然科学基金(21275126).

张紫恒(1990-), 男, 硕士生，研究方向为高分子化学与物理.*

O658

A

1008-1011(2016)06-0737-05