抗人蔗糖酶卵黄抗体的制备及其稳定性和体外活性研究①

邵 敏 王新颖 卢毓璁 王 敏 冯 昆 魏妮娜 杜凤霞 周鹤峰

(遵义医学院珠海校区生物工程系，珠海519041)

·免疫学技术与方法·

抗人蔗糖酶卵黄抗体的制备及其稳定性和体外活性研究①

邵 敏 王新颖 卢毓璁 王 敏 冯 昆 魏妮娜 杜凤霞②周鹤峰

(遵义医学院珠海校区生物工程系，珠海519041)

目的：制备抗人蔗糖酶(Sucrase，SUC)卵黄抗体(egg yolk immunoglobulin Y,IgY)并对其稳定性、体外活性进行研究。方法：采用人SUC蛋白为抗原，免疫海兰灰蛋鸡，水稀释和盐析法提取纯化IgY；间接ELISA法监测抗体效价变化并评价其稳定性；SDS-PAGE和Western blot分析IgY的纯度和特异性；PNPG法测IgY对α-葡萄糖苷酶的体外抑制效果。结果：初次免疫10 d后检测到IgY，40 d后效价最高达到1∶12 800；提取的IgY重链和轻链分别在65 kD和25 kD处，且能够与抗原蛋白特异性结合；29～69℃范围内水浴15 min和pH 4～7之间37℃水浴4 h，抗体效价无变化；胰蛋白酶与胃蛋白酶作用IgY 2 h，抗体效价降至一半，延长作用时间，IgY对胃蛋白酶耐受力较胰蛋白酶耐受力更强；IgY对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，呈现剂量相关性，半抑制浓度(IC50)值为0.540 mg/ml。结论：抗人蔗糖酶卵黄抗体(S-IgY)的成功制备为后续用于2型糖尿病大鼠模型体内实验研究奠定基础。

蔗糖酶；鸡；卵黄抗体；稳定性

糖尿病是以高血糖为特征的慢性代谢性疾病。α-葡萄糖苷酶抑制剂是目前临床治疗2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)口服降糖的主要药物之一，该药物能够竞争性抑制小肠绒毛中α-葡萄糖苷酶的活性，延缓多糖和双糖的分解，延迟小肠上段葡萄糖的吸收，达到降低餐后血糖的目的。目前已经上市并在临床上广泛使用的为阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，这3种药物都是在微生物及其代谢产物基础上通过化学修饰改造获得，一方面工艺复杂，另一方面在临床应用中存在一定副作用[1,2]。国内外科研人员正不断从动植物、海洋生物等原材料中探索具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分，但天然来源α-葡萄糖苷酶抑制剂其材料有限，同时抑制效果尚需进一步评价[3-5]。因此，探索新型来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有潜在的应用价值。

IgY是将免疫原免疫禽类后，通过其免疫系统产生的能蓄积在卵细胞中的特异性抗体，该抗体产量高，获得容易，价格低廉、具有相对稳定的耐热、耐酸等化学性质，已经在疾病诊断和防治等方面有广泛的研究和应用[6,7]。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)位于小肠膜上皮细胞刷状缘侧，由麦芽糖酶、葡萄糖化酶、SUC和异麦芽糖酶4种组成[8]。本课题组在前期研究中已经通过基因工程手段获得人SUC蛋白[9]，以其作为抗原，免疫产蛋鸡，获得特异性抗人S-IgY，通过对获得的抗体进行稳定性评价和体外活性等方面的研究，为今后以口服抗体药物作为治疗T2DM的新型降糖药物类型的研究和开发奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 人SUC蛋白(本课题组前期实验获得)；弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、α-葡萄糖苷酶(Sigma 美国)；聚丙烯酰胺、蛋白质Marker(TaKaRa 日本)；Western blot 检测试剂(碧云天公司)；阿卡波糖(拜耳公司 德国)。

1.1.2 仪器 冷冻高速离心机(德国 Eppendorf公司生产)；蛋白质电泳仪、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司生产)；Elx-800全自动酶标仪(美国Bio-Tek公司生产)。

1.1.3 实验动物 海兰灰品种产蛋鸡12只，25周龄，体重1.8～2.0 kg，珠海市金湾区养殖基地提供，饲养于遵义医学院珠海校区动物房，鸡饲料也由养殖基地提供。

1.2 方法

1.2.1 蛋鸡免疫 将蛋鸡随机分为正常对照组和免疫SUC组。将前期实验得到的人SUC蛋白用PBS稀释成0.25 mg/ml，以1.0 ml/只的用量于蛋鸡颈部、翼下和胸肌皮下多点免疫，首次免疫使用弗氏完全佐剂，免疫时间间隔均为2周，后续3次免疫使用弗氏不完全佐剂，对照组用PBS与佐剂乳化后免疫注射。首免后7 d开始，每天收集鸡蛋并标记，4℃保存备用，间接ELISA法监测IgY效价。

1.2.2 IgY的提取纯化 采用水稀释和盐析法提取纯化IgY。75%乙醇擦拭与消毒鸡蛋表面，无菌条件下分离蛋黄与蛋清，注射器吸取蛋黄并加入8倍体积的双蒸水，调节pH为5.2，4℃静置8 h。10 000 r/min离心25 min，上清加无水硫酸钠至终浓度为19%(W/V)静置2 h后10 000 r/min离心25 min，PBS溶解沉淀，加无水硫酸钠至终浓度为14%(W/V)，静置2 h，10 000 r/min离心25 min， 取沉淀用PBS溶解，以截留分子量为14 kD透析袋4℃透析过夜，制备的IgY -20℃保存。

1.2.3 IgY的SDS-PAGE与Western blot分析 将提取纯化的IgY进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%，考马斯亮蓝R-250染色后观察并拍照。将人SUC重组蛋白行SDS-PAGE后转PVDF膜，用提取纯化后的抗人S-IgY为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG为二抗，进行Western blot分析，以对照组提取的IgY作为阴性对照 。

1.2.4 间接ELISA法监测IgY效价 用间接ELISA法对提取的抗人S-IgY进行动态监测，按参考文献进行[10]。以10 μg/ml重组蛋白人SUC包被酶标板，4℃过夜后， 5%脱脂奶粉PBST 37℃封闭2 h，PBST洗板5次，以1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800不同倍比稀释的抗人S-IgY，每孔100 μl，37℃孵育2 h，洗板后加入酶标二抗，37℃ 2 h，加TMB显色，终止液终止反应，在450nm处测A值。设置阴性对照(对照组鸡蛋提取的IgY)与PBS空白对照。待测IgY的A450nm值与阴性对照组IgY A450nm值之比大于2.1为阳性结果。

1.2.5 IgY的热稳定性试验 抗人S-IgY用0.05 mol/L Tris-Cl缓冲液稀释成1 mg/ml，置于29℃、39℃、49℃、59℃、69℃、79℃、89℃、99℃不同温度的水浴中15 min，结束后立即放入冰水中冷却，并以1∶50、1∶200、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800不同稀释倍数下，每一条件设置6个复孔，用间接ELISA法检测抗体效价，以对照组鸡蛋提取的IgY为阴性对照。

1.2.6 IgY的酸碱稳定性试验 抗人S-IgY用pH值1～9的0.05 mol/L Tris-Cl缓冲液稀释成1 mg/ml，37℃水浴4 h，立即用2 mol/L Tris溶液中和，调pH为7.0，并以1∶50、1∶200、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800不同稀释倍数下，每一条件设置6个复孔，用间接ELISA法检测抗体效价，以对照组鸡蛋提取的IgY为阴性对照。

1.2.7 IgY的胃蛋白酶消化试验 抗人S-IgY用pH为4.0，0.05 mol/L Tris-Cl缓冲液稀释成1 mg/ml，以10∶1的比例在IgY中加入浓度为1 200 U/ml胃蛋白酶溶液，37℃保温，在2、4、6、8 h不同时间点取样检测，用2 mol/L Tris溶液中和pH为7.0，并以1∶50、1∶200、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800不同稀释倍数下，每一条件设置6个复孔，用间接ELISA法检测抗体效价，以对照组鸡蛋提取的IgY为阴性对照。

1.2.8 IgY的胰蛋白酶消化试验 抗人S-IgY用pH为8.0，0.05 mol/L Tris-Cl缓冲液稀释成1 mg/ml，以10∶1的比例在IgY中加入浓度为50 mg/ml的胰蛋白酶，37℃保温，在2、4、6、8 h不同时间点取样检测，用2 mol/L Tris溶液中和pH为7.0，并以1∶50、1∶200、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800不同稀释倍数下，每一条件设置6个复孔，用间接ELISA法检测抗体效价，以对照组鸡蛋提取的IgY为阴性对照。

1.2.9 IgY对α-葡萄糖苷酶体外抑制试验 10 U/ml α-葡萄糖苷酶20 μl与不同浓度梯度的各200 μl抗人S-IgY和阳性对照阿卡波糖充分混合，以同体积缓冲液作为空白对照，待测样品与阳性对照样品浓度梯度分别为0.01、0.1、0.25、0.5、1 mg/ml，每一条件设置6个复孔，37℃水浴保温5 min，加入1 mmol/L底物PNPG 200 μl充分混匀，37℃水浴反应20 min，加入1 mol/L的碳酸钠溶液500 μl终止反应，在波长405nm下读取吸光度值。按以下公式分别计算抗人S-IgY和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率(%)：抑制率(%)=[A空白-(A样品-A)]/ A空白×100%，公式中A为只加样品测定的吸光度值，作为本底。以半抑制浓度值(IC50)评价样品对α-葡萄糖苷酶的抑制程度。

2 结果

2.1 IgY的SDS-PAGE与Western blot分析 将提取纯化的抗人S-IgY进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示有两条明显蛋白条带，与蛋白质Marker对比， 表明IgY重链在65 kD处，轻链在25 kD处，如图1。将蛋白转膜后进行Western blot分析，图2所示，获得的抗人S-IgY能够与抗原蛋白特异性结合，阴性对照未出现结合反应，表明已经成功制备了抗人S-IgY。

2.2 IgY的效价监测 采用间接ELISA法监测抗人S-IgY效价变化情况，结果如图3，以SUC蛋白为免疫原免疫蛋鸡，在首免后第10天检测到抗人S-IgY，随着后续加强免疫，抗体效价逐渐增加，到40 d效价达到最高峰为1∶12 800，即在三免和四免后一段时间出现抗体效价最高，抗体维持20 d平台期后效价逐渐下降，3个月后基本降至1∶2 000 以下。

图1 抗人S-IgY的电泳图Fig.1 SDA-PAGE analysis of S-IgYNote:M.Marker;1.S-IgY.

图2 Western blot检测抗人S-IgY的特异性Fig.2 S-IgY specificity detected by Western blotNote:M.Marker;1.S-IgY;2.Non-immunized IgY.

图3 抗人S-IgY效价消长规律Fig.3 Titer variation of S-IgY after primary immunization

表1 抗人S-IgY的热稳定性

Tab.1 Thermal stability of S-IgY

Temperature(℃)IgYtiter291∶6400391∶6400491∶6400591∶6400691∶6400791∶1600891∶5099-

表2 抗S-IgY的酸碱稳定性

Tab.2 Acid-base stability of S-IgY

pHIgYtiter1-2-31∶320041∶640051∶640061∶640071∶640081∶320091∶1600

2.3 热稳定性检测 抗人S-IgY在29～69℃范围内水浴15 min抗体效价无任何变化，当温度大于79℃以上，抗体效价大幅降低直至无活性，结果如表1。

2.4 酸碱稳定性检测 表2所示，抗人S-IgY在pH 4～7之间37℃水浴4 h抗体效价无任何变化，当pH≤3时，抗体效价大幅降低直至无活性，pH≥8时，抗体效价大幅下降。

2.5 胃蛋白酶和胰蛋白酶对IgY的影响 抗人S-IgY在胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下都有一定程度的影响，在酶作用2 h后，抗体效价降至一半，再次增加作用时间，抗体效价进一步降低，8 h检测不到活性。胰蛋白酶与胃蛋白酶相比，抗体效价降低更为明显，说明IgY对胰蛋白酶耐受力更差，结果如表3所示。

2.6 阿卡波糖和IgY对α-葡萄糖苷酶体外抑制性影响 不同浓度的抗人S-IgY和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制结果如表4所示，随着浓度不断增加，阳性对照阿卡波糖和抗人S-IgY对α-葡萄糖苷酶抑制活性逐渐增加，呈现剂量相关性。抗人S-IgY对α-葡葡萄糖苷酶有一定的抑制性，其IC50值为0.540 mg/ml，但与阿卡波糖(IC50=0.160 mg/ml)的抑制作用相比较弱，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 胃蛋白酶和胰蛋白酶对S-IgY活性的影响

Tab.3 Resistance of S-IgY against pepsin and trypsin

Time(h)IgYtiterPepsinTrypsin01∶64001∶6∶40021∶32001∶320041∶16001∶80061∶8001∶2008--

表4 抗人S-IgY和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率

Tab.4 Inhibition ratio of acarbose and S-IgY on activity of α-glucosidase

GroupsInhibitoryconce⁃ntration(mg/ml)Inhibitionrate(%)Blankcontrol--Acarbose001136±130S⁃IgY00126±0301)Acarbose010367±060S⁃IgY010194±0491)Acarbose025492±370S⁃IgY025315±1901)Acarbose050730±260S⁃IgY050473±2101)Acarbose100905±140S⁃IgY100649±5801)

Note：Compared with acarbose group，1)P<0.05 under the equal inhibition concentration.

3 讨论

T2DM治疗过程中，在配合饮食治疗基础上使用α-葡萄糖苷酶抑制剂抑制α-葡萄糖苷酶的活性达到降低餐后血糖升高的目的。本实验选择其中SUC作为靶点，体外通过免疫手段获得相应IgY，通过抗原抗体的中和反应，以期通过口服抗体控制餐后高血糖，该研究目前在国内外未见报道。

IgY在免疫制备过程中，免疫的途径，注射部位，抗原用量，间隔时间，免疫次数等都是影响免疫效果的因素，本研究通过人SUC蛋白作为抗原进行4次免疫，采用弗氏佐剂和弗氏不完全佐剂，通过间接ELISA检测抗体效价变化，在首免10 d检测到抗体，40 d达到最高效价1∶12 800，且持续20 d。蛋鸡在注射抗原后，生长状态和产蛋率未受到任何影响，抗体效价水平已能够满足后续实验需要，与相关研究对比发现，虽然高岭等[11]曾报道高效价卵黄抗体持续5周以上，时间较长，但本实验可以通过提高海兰灰蛋鸡的产蛋率，另外也可以增加蛋鸡免疫数量这两方面使获得的抗体量增加。

若将IgY作为口服制剂用于降低血糖，需进行其对酸碱和温度的耐受力、口服后在胃蛋白酶和胰蛋白酶水解作用下的稳定性等方面研究。实验发现，IgY可以耐受巴氏杀菌处理，且效价不变；pH 4～7范围内抗体活性稳定，pH≤3时，抗体效价大幅降低直至无活性，与文献报道基本一致[12,13]，当pH≥8时，抗体效价也大幅度下降。在酸碱稳定性实验的基础上，在进行酶水解作用时，考虑到胃液和肠液不同的酸碱环境，选定pH为4的 Tris-Cl缓冲液稀释抗人S-IgY 和pH为8的Tris-Cl缓冲液稀释抗人S-IgY，分别进行胃蛋白酶与胰蛋白酶的作用，在2 h后均出现抗体效价大幅度下降情况，综合以上研究结果，在后续实验中需要探讨添加合适的保护剂或将IgY制成不同剂型，使IgY能够耐受酸性环境，使其在酶的作用下维持效价稳定，同时在此保护剂和不同剂型的条件下，研究其在不同温度不同存放时间的条件下抗体效价变化等情况，以此才能作为今后口服降糖药物的研究基础。

IgY用于动物体内实验前，需要体外对其活性进行探讨。实验中对比阳性对照阿卡波糖和抗人S-IgY对α-葡萄糖苷酶抑制活性，表明抗人S-IgY对α-葡葡萄糖苷酶有一定的抑制性，其IC50值为0.540 mg/ml，本研究为进一步探讨IgY在动物体内的降糖效果和降糖作用机制奠定基础。

[1] 王 凯.α-葡萄糖苷酶抑制剂的来源、筛选模型及临床研究进展[J].中国药房,2014,25(41):3919-3922.

[2] 范 莉,王业玲,唐 丽.天然来源α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法的研究进展[J].天然产物研究与开发,2016,28(2):313-321.

[3] Shan X,Liu X,Hao J,etal.In vitro and in vivo hypoglycemic ef-fects of brown algal fucoidans[J].Int J Biol Macromol,2016,82:249-255.

[4] Oh J,Jo SH,Kim JS,etal.Selected tea and tea pomace extracts inhibit intestinal α-glucosidase activity in vitro and postprandial hyperglycemia in vivo[J].Int J Mol Sci,2015,16(4):8811-8825.

[5] Satoh T,Igarashi M,Yamada S,etal.Inhibitory effect of black tea and its combination with acarbose on small intestinal α-glucosidase activity[J].J Ethnopharmacol,2015,161:147-155.

[6] Borhani K,Mobarez AM,Khabiri AR,etal.Production of specific IgY Helicobacter pylori recombinant OipA protein and assessment of its inhibitory effects towards attachment of H.pylori to AGS cell line[J].Clin Exp Vaccine Res,2015,4(2):177-183.

[7] Wen J,Zhao S,He D,etal.Preparation and characterization of egg yolk immunoglobulin Y specific to influenza B virus[J].Antiviral Res,2012,93(1):154-159.

[8] Rodríguez D,Ramsay AJ,Quesada V,etal.Functional analysis of sucrase-isomaltase mutations from chronic lymphocytic leukemia patients[J].Hum Mol Genet,2013,22(11):2273-2282.

[9] 邵 敏,王新颖,张青峰,等.人SUC蛋白在大肠杆菌的诱导表达与纯化[J].细胞与分子免疫学杂志,2015,31(12):1629-1632.

[10] 朱思思,赵肃清,李月明,等.抗肠道病毒71型特异性卵黄抗体的制备及鉴定[J].中国免疫学杂志,2011,27(10):913-921.

[11] 高 岭,刘聚祥,杨娜娜,等.猪传染性胃肠炎和流行性腹泻卵黄抗体水平的动态检测[J].河北农业大学学报,2013,36(6):93-96.

[12] Zhang S,Xing P,Guo G,etal.Development of microbeads of chicken yolk antibodies against Clostridium difficile toxin A for colonic-specific delivery[J].Drug Deliv,2016 23(6):1940-1947.

[13] Lee KA,Chang SK,Lee YJ,etal.Acid stability of anti-Helicobacter pyroli IgY in aqueous polyol solution[J].J Biochem Mol Biol,2002,35(5):488-493.

[收稿2016-06-28 修回2016-08-26]

(编辑 张晓舟)

Preparation,stability and in vitro activity of egg yolk immunoglobulin Y against human Sucrase

SHAO Min,WANG Xin-Ying,LU Yu-Cong,WANG Min，FENG Kun,WEI Ni-Na，DU Feng-Xia,ZHOU He-Feng.

Department of Bioengineering,Zunyi Medical College Zhuhai Campus,Zhuhai 519041,China

Objective:To prepare the egg yolk immunoglobulin Y (IgY) against human Sucrase and study its stability,in vitro activity.Methods:Hy-line laying hens were immunized with human Sucrase protein,IgY was isolated and purified from egg yolks of immunized hens using water dilution and salting out method.Indirect ELISA was used to evaluate the titer and stability of IgY.The purity and specificity of IgY were analysed by SDS-PAGE and Western blot respectively.The inhibitory effects of IgY on α-glucosidase was studied by PNPG method.Results:Indirect ELISA results showed IgY could be detected on the tenth day after the first immunization,and the peak titer of IgY was 1∶12 800 after the 40th day of immunization.SDS-PAGE showed that the heavy chain and light chain of IgY were 65 kD and 25 kD respectively,and the IgY against human Sucrase could specifically recognize the protein of human Sucrase.The IgY maintained primary titer when it was kept between 29-69℃ for 15 min,and pH 4-7,37℃,4 h.The titer of IgY was maintained 50% after digestion by pepsin and trypsin respectively for 2 hours.IgY had a higher resistence to pepsin than trypsin after longer digestion time.IgY showed an inhibitory effect on α-glucosidase in concentration dependent manner.The half inhibitory concentration (IC50) was 0.540 mg/ml.Conclusion:The IgY against human Sucrase has been successfully obtained,which established foundations for its study of Type 2 diabetes mellitus rat models in vivo.

Sucrase;Hen;IgY;Stability

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.013

①本文受贵州省科技厅基金项目[黔科合SY字(2012)3091]和2010年遵义医学院青年科研启动基金(F-501)资助。

邵 敏(1978年-),女,硕士,副教授,主要从事分子生物学研究，E-mail:sm780909@163.com。

及指导教师：周鹤峰(1980年-),男,硕士,教授,主要从事医药生物技术的研究。

R392.11

A

1000-484X(2016)12-1785-05

②齐齐哈尔医学院病原教研室,齐齐哈尔161000。