等离子诱变选育木糖醇高产菌及发酵条件优化

周龙霞，王燕*，郭玉蓉，张海涛，孙自顶，王志超

(1.齐鲁工业大学 生物工程学院，山东省微生物工程重点实验室，济南 250353；2.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，西安 710062)

等离子诱变选育木糖醇高产菌及发酵条件优化

周龙霞1，王燕1*，郭玉蓉2，张海涛1，孙自顶1，王志超1

(1.齐鲁工业大学 生物工程学院，山东省微生物工程重点实验室，济南 250353；2.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，西安 710062)

以热带假丝酵母Y-14(Tropicalcandida)为出发菌株，采用等离子体对其进行诱变，得到最佳诱变条件：在功率120 W下处理150 s，致死率达到96%。诱变后经过筛选得到1株高产木糖醇的菌株Y-117，与出发菌株相比，其木糖醇产量提高了30.4%。在单因素试验的基础上，通过响应面分析试验对菌株Y-117的发酵条件进行优化，得到最佳条件：初始木糖添加量105 g/L、温度30.5 ℃、摇床转速190 r/min。在此条件下，Y-117的木糖醇产量为76.45 g/L，比出发菌株高42%。

木糖醇；热带假丝酵母；等离子诱变；响应面法

木糖醇是甜味调味品的一种，目前在人们的日常生活中作为调味品得到广泛应用。木糖醇(xylitol)即戊五醇，分子式为C5H12O5，是木糖代谢的正常中间产物，外形为结晶性白色粉末，广泛存在于水果、蔬菜、谷类等食物和木材、稻草秸秆及玉米芯等植物中。木糖醇作为一种甜味调味品易溶于水，其甜度与蔗糖相近，但热量仅为蔗糖的1/3，广泛用于糖果、饮料和糕点等生产加工以及人们的日常生活中[1]。木糖醇具有预防龋齿的功效，对人体的血糖值上升没有影响，可作为糖尿病人食用的营养型食糖替代品。因为木糖醇本身不含羰基，且有较强的化学稳定性，因此作为食品添加剂可以延长食品的保鲜期[2]。近几年，由于木糖醇在食品、调味品、医药和轻工等行业的应用，木糖醇已经得到广泛关注。

目前国内外生产木糖醇的主要方法为化学合成法，化学合成法生产木糖醇工艺比较成熟，但是由于其工艺要求成本高、耗能大且污染较严重等缺点，也影响了其行业的发展；相对于化学合成法，生物转化法以其条件温和、转化过程安全、消耗资源少等优点而受到广泛关注[3]。能够利用木糖发酵产木糖醇的微生物中，酵母转化能力最强(尤其是热带假丝酵母菌属)。目前木糖醇的生产效率低是微生物转化法生产木糖醇的瓶颈问题，木糖醇产率是限制微生物转化法生产木糖醇规模化的关键因素。

通过微生物育种技术进行生产菌株的选育是提高发酵生产木糖醇能力的途径之一。常温等离子(Atmospheric and Room Temperature Plasma, ARTP)诱变技术是一种新型的诱变技术，ARTP具有操作简单、安全性高、环境友好、突变速度快、突变率高和突变多样性等特点，能够快速突变微生物，是一种新型的生物诱变方法[4]。

本实验对实验室保藏的热带假丝酵母Y-14进行等离子诱变，筛选得到遗传性状稳定的高产突变菌株Y-117，并通过单因素试验和响应面法试验对Y-117的发酵条件进行优化，显著提高了菌株的木糖醇产量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

热带假丝酵母Y-14分离于存放玉米芯的土壤中，由本实验室保藏。

1.1.2 主要试剂与仪器

试剂：木糖；酵母膏；蛋白胨；七水硫酸镁；磷酸氢二钾；氯化钠；硫酸铵；琼脂粉；变色酸；氯化亚锡。

仪器：DL-5-B飞鸽牌离心机；PHS-25数显pH计；SHP-150数显生化培养箱；HYG-A全温摇瓶柜；ARTP诱变系统；722型分光光度计。

1.1.3 培养基[5]

斜面培养基：木糖 100 g/L，酵母膏3 g/L，七水硫酸镁 1 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，氯化钠2 g/L，琼脂粉20 g/L，pH 6.0，115 ℃灭菌30 min。

平板培养基：同斜面培养基。

种子培养基：木糖 100 g/L，酵母膏3 g/L，蛋白胨5 g/L，七水硫酸镁 1 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸铵2 g/L， pH 6.0，115 ℃灭菌30 min。

发酵培养基：木糖 100 g/L，酵母膏3 g/L，硫酸铵2 g/L，七水硫酸镁 1 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，氯化钠2 g/L， pH 6.0，115 ℃灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 等离子诱变

本试验工作气体为氦气，工作气流量为10 SLM，处理距离为2 mm，电源输出功率为120 W[6]。将试验前培养的处于对数期的菌体进行梯度稀释，制备菌悬液，取菌悬液进行等离子诱变，以处理时间作为诱变参数，处理时间为30，60，90，120，150，180，210，240 s。将照射后的菌液进行适当稀释后涂布到平板培养基上，对照组未经诱变的菌液做同样处理，每组试验做3个平行，30 ℃下培养。记录菌落数目，计算致死率。将优势单菌落接种到种子培养基中，测定发酵液中木糖醇产量，确定优势菌株。

致死率=(对照组活菌数目-诱变处理后活菌数目)/ 对照组活菌数目×100%。

1.2.2 突变菌株遗传稳定性测定

将筛选出的木糖醇高产菌株低温保藏，连续传代8次，测定每一代菌株的木糖醇产量及转化率。

1.2.3 木糖含量测定

利用DNS法测定发酵液中木糖残余量[7]。

1.2.4 木糖醇含量测定

利用变色酸法测定发酵液中木糖醇产量[8]。

1.2.5 生物量测定

取适量发酵液离心，用蒸馏水清洗2遍后，放于烘箱内60 ℃烘干至恒重，用天平称量重量，以每1 L发酵液中所含干菌体克数表示生物量。

1.2.6 单因素试验

主要考察不同因素条件对木糖醇产量及转化率的影响。

1.2.6.1 初始木糖浓度

在 250 mL 三角瓶中装入 50 mL木糖发酵培养基，初始木糖添加量分别为 60，80，100，120，150，180 g/L，种子液接种量为 10%，放置于摇床上30 ℃，180 r/min，发酵培养至所需时间。

1.2.6.2 温度

在 250 mL 三角瓶中装入 50 mL木糖发酵培养基，种子液接种量为 10%，恒温摇床温度分别设为 25，28，30，32，34，36 ℃，180 r/min，发酵培养至所需时间。

1.2.6.3 pH

在 250 mL 三角瓶中装入 50 mL木糖发酵培养基，种子液接种量为 10%，初始 pH 分别为 5，5.5，6.0，6.5，7.0，放置于摇床上30 ℃，180 r/min，发酵培养至所需时间。

1.2.6.4 转速

在 250 mL 三角瓶中装入 50 mL木糖发酵培养基，种子液接种量为 10%，摇床转速分别为 140，160，180，200，220 r/min，30 ℃，发酵培养至所需时间。

1.2.6.5 接种量

在 250 mL 三角瓶中装入 50 mL木糖发酵培养基，将种子液接种量分别设定为 6%，8%，10%，12%，14%，放置于摇床上30 ℃，180 r/min，发酵培养至所需时间。

1.2.7 响应面分析法

在单因素试验的基础上，以木糖醇产量为试验指标，确立影响木糖醇发酵的主要因素。以初始木糖浓度、温度和转速为试验因素，设计三因素三水平的Box-Behnken试验，进行响应面分析试验，以获得菌株的最佳发酵条件。

2 结果与分析

2.1 高产菌株的筛选

2.1.1 ARTP诱变条件确定

经过ARTP诱变后，不同诱变时间菌株的致死率结果见表1。

表1 ARTP诱变的致死率
Table 1 The lethality of ARTP mutation

处理时间(s)306090120150180210240致死率(%)37.649.373.489.196.3100100100

由表1可知，随着诱变时间的增加，致死率也不断上升，在150 s时，致死率达到96.3%以上，之后随时间增加，致死率接近100%，为使菌株获得较好的正突变，实验选择150 s作为ARTP的诱变条件。

2.1.2 诱变菌株的筛选

根据菌落生长的形态，从ARTP诱变后的单菌落中挑选得到153个单菌落。将筛选得到的菌株接种到发酵培养基中，30 ℃，180 r/min摇床培养，经过数次重复试验，筛选出木糖醇含量较高的正突变菌株18株，其中突变株Y-117的发酵液中木糖醇转化率最高为74.36%，木糖醇产量为70.38 g/L，菌体浓度为15.36 g/L。相比出发菌株Y-14的木糖醇产量提高了31.04%。

2.1.3 突变株遗传稳定性测定

将突变株Y-117连续传代8次，测定其木糖醇产量，结果见图1。

图1 突变株Y-117遗传稳定性试验Fig.1 Genetic stability test of mutant strain Y-117

由图1可知，菌株Y-117经过连续传代8次后，木糖醇产量较稳定，由此说明其遗传性能稳定，可作为后续发酵试验的菌株。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 不同初始木糖浓度对木糖醇转化的影响

表2 初始木糖浓度对菌株Y-117木糖醇转化能力的影响
Table 2 The effect of initial xylose concentration on xylitol transforming ability of strain Y-117

初始木糖浓度(g/L)木糖残余量(g/L)木糖醇产量(g/L)转化率(%)菌体浓度(g/L)60026.1843.6313.5880049.4864.8514.731005.7275.4279.9515.3612027.6464.8769.8214.4315059.3352.0457.4113.6918049.1849.1352.0213.07

由表2可知，随着发酵液中初始木糖浓度的增加，木糖醇的产量及转化率先增加后降低，木糖残余量则呈上升趋势。当初始木糖浓度过低时，木糖多作为菌体生长的碳源被利用，因此转化率较低。当初始木糖浓度为100 g/L时，菌体生长最快，木糖醇产量和转化率都达到最大，转化率为79.97%。当初始木糖浓度不断增大，菌体浓度和木糖醇产量都有明显下降，这说明高浓度的初始木糖浓度对菌体有抑制作用，导致发酵周期变长。综合考虑木糖醇产量和转化率，选择100 g/L初始木糖浓度比较有利于菌株Y-117木糖醇的转化。

2.2.2 不同温度对木糖醇转化的影响

温度是影响微生物酶活性的重要因素，相关研究证明酵母菌的最适温度一般为30 ℃左右，温度主要影响菌体代谢中关键酶的活性，温度过高或过低都会对酶的活性产生影响[9]。本试验考察温度从25～36 ℃对于菌株转化木糖醇的影响，结果见图2。

图2 不同温度对木糖醇转化的影响Fig.2 The effect of different temperatures on the transforming of xylitol

随着温度的不断升高，木糖醇产量也在不断积累增加，当温度为30 ℃时，木糖醇产量最高为73.52 g/L，此时的木糖醇转化率最高，当温度高于30 ℃时，木糖醇的积累量和转化率都开始下降。因此，确定30 ℃为菌株Y-117的最佳转化温度。

2.2.3 初始pH对木糖醇转化的影响

不同初始pH对于菌株的转化能力有很大影响，pH主要影响菌株的菌体繁殖和生长代谢过程，对目的产物的积累有较大影响[10]。本文研究不同初始pH对菌株Y-117转化木糖醇的影响，结果见图3。

图3 初始pH对菌株Y-117转化木糖醇的影响Fig.3 The effect of initial pH value on xylitol transforming ability of strain Y-117

初始pH由5.0增大到7.0的过程中，木糖醇的产量、转化率及菌体量随着pH的增加先增大后减小，pH为6.0时条件最佳，且菌体量与木糖醇产量呈正相关关系。

2.2.4 不同转速对木糖醇转化的影响

转速是发酵过程中控制溶氧的重要途径。研究表明溶氧是影响木糖醇转化的关键因素[11]，发酵液中的溶氧量不仅对木糖醇的产量有影响，对菌体的生长和副产物的产生也有一定的影响。本文通过改变摇床的转速来考察溶氧对于菌株Y-117转化木糖醇能力的影响，结果见表3。

表3 转速对木糖醇转化的影响
Table 3 The effect of rotation speed on the transforming of xylitol

转速(r/min)菌体浓度(g/L)木糖残余量(g/L)木糖醇产量(g/L)转化率(%)14013.018.0265.2470.9316014.616.7468.4973.4518015.974.3673.4877.1620014.327.3867.0472.8222012.8110.0361.3968.21

由表3可知，随着摇床转速的增加，菌体的木糖消耗速度和木糖醇的产量先增大后减小，当转速为180 r/min时，木糖醇积累量达到最大为73.48 g/L，此时菌株转化木糖醇的能力也是最强的。所以，摇床试验中选择转速180 r/min为最佳条件。

2.2.5 不同接种量对木糖醇转化的影响

种子液的接种量不同对木糖醇的转化也有一定影响，当接种量较低时，可能会造成菌体生长缓慢，延长发酵时间；当接种量过大时，菌体会大量消耗培养液中的营养成分，导致代谢产物积累量过少。本文考察接种量为6%，8%，10%，12%，14%时菌株的转化能力，结果见图4。

图4 不同接种量对菌株Y-117转化木糖醇的影响Fig.4 The effect of inoculum size on xylitol transforming ability of strain Y-117

当接种量为10%时，发酵液中木糖醇产量最大为75.46 g/L，木糖残余量最少，且此时转化率最大为78.43%。当接种量低于10%时，菌体浓度低，生长缓慢，从而导致木糖醇的转化率不高；当接种量大于10%时，菌体会消耗过多的底物，从而导致木糖醇的产量下降。因此，选择接种量10%为最佳接种量。

2.3 响应面分析法

2.3.1 响应面分析因素水平的选取及试验设计

以初始木糖浓度(A)、温度(B)和转速(C)为试验因素，根据Box-Behnken试验设计原理，以木糖醇产量为评价指标，设计三因素三水平17个试验点的响应面分析，其中零点试验重复5次，试验因素水平和编码见表4。

表4 中心组合试验设计因素及水平表
Table 4 Factors and levels of Box-Behnken design

因素水平-101A初始木糖浓度(g/L))80100120B温度(℃)283032C转速(r/min)160180200

采用Design-Expert 8.0.5b统计软件进行分析，响应面分析试验的结果见表5。

表5 中心组合试验设计方案及结果
Table 5 Box-Behnken design and results

试验序号ABC木糖醇产量(g/L)100076.03211075.1331-1069.574-10-168.155-1-1070.84601-172.717-11071.28800075.83901173.9310-10174.161100075.951200075.691310-172.311400075.811510174.08160-1-168.46170-1173.19

2.3.2 回归模型建立及分析

利用Design-Expert 8.0.5b软件对表5中数据进行回归分析，得到木糖醇产量对自变量A，B，C的回归方程：

木糖醇产量(g/L)=75.86+0.83A+1.37B+1.72C+1.28AB-1.06AC-0.88BC-2.03A2-2.13B2-1.66C2。

对模型进行方差分析及对系数进行显著性检验，结果见表6。

表6 响应面回归系数的方差分析
Table 6 Analysis of variance for the response surface

来源平方和自由度均方F值P值模型111.90912.4397.06<0.0001A5.5415.5443.28<0.0001B15.10115.10117.860.0003C23.56123.56183.96<0.0001AB6.5516.5551.160.002AC4.4914.4935.090.0006BC3.0813.0824.050.017A217.30117.30135.09<0.0001B219.10119.10149.10<0.0001C211.60111.6090.55<0.0001残差0.9070.13失拟项0.8330.2815.920.1090净误差0.06940.017合计112.7916

由表6可知，P<0.05表示该指标显著，模型P<0.0001表示极其显著；失拟值P=0.109>0.05表示无显著性差异。由此说明模型拟合有效，可用此模型和方程来分析木糖醇的产量。

软件分析得到模型的校正决定系数Radj2=98.18%，说明该实验方法是可靠的，此模型数据拟合度较好，试验误差较小。由回归模拟系数显著性检验结果中可知其中A和C的影响最为显著；B的影响显著；方程的二次项AA，BB，CC都极显著；交互项中AC极显著，说明初始木糖添加量(A)与转速(C)对木糖醇产量的交互作用影响更明显。由此可得出3个因素对结果的影响排序为：初始木糖添加量>转速>温度。

2.3.3 响应面分析与优化

根据回归方程做出模型的响应面及等高线图，结果见图5～图7。

图5 初始木糖添加量与温度对木糖醇产量影响的响应面图(a)和等高线图(b)Fig.5 The response surface plot(a)and the contour(b)for the effects of initial xylose amount and temperature on the production of xylitol

图6 初始木糖添加量与转速对木糖醇产量影响的响应面图(a)和等高线图(b)Fig.6 The response surface plot(a)and the contour(b)for the effects of initial xylose amount and rotation speed on the production of xylitol

图7 温度与转速对木糖醇产量影响的响应面图(a)和等高线图(b)Fig.7 The response surface plot(a)and the contour(b)for the effects of temperature and rotation speed on the production of xylitol

由响应面的最高点与等值线可以看出，初始木糖添加量(A)与转速(C)的交互作用明显，这与方差分析的结果一致，经优化后得到：当(A,B,C)=(0.206,0.308，0.371)时，此时木糖醇的产量最大。

2.3.4 最佳发酵条件确定及验证试验

通过响应值分析得到最佳发酵条件：初始木糖添加量为104.14 g/L；温度为30.618 ℃；转速为187.1 r/min。在此条件下，木糖醇产量最大为76.48 g/L。结合实际试验条件，确定初始木糖添加量为105 g/L；温度为30.5 ℃；转速为190 r/min，其他条件不变，进行验证试验，经过多次试验得到木糖醇产量为76.43 g/L，与理论预测值相差不大。

3 结论

等离子诱变是一种新兴的诱变育种技术，本文通过等离子诱变方法选育出一株遗传性状稳定、木糖醇产量较高的菌株Y-117，其木糖醇产量由原来的54.06 g/L提高到71.38 g/L。在微生物代谢产物研究中，发酵条件的优化起着重要作用，本文在单因素试验的基础上，利用响应面法对菌株Y-117的发酵条件进行优化，通过Box-Behnke试验，然后结合统计软件Design-Expert 8.0.5b进行二次回归模型拟合及方差分析，得到最佳发酵条件：初始木糖添加量为105 g/L，温度为30.5 ℃，摇床转速为190 r/min。经多次试验验证，此发酵条件下木糖产量达到76.43 g/L，与原始菌株相比提高了41.38%。

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Mutation Breeding of High-yield Xylitol Strain by Plasma and Optimization of Fermentation Conditions

ZHOU Long-xia1, WANG Yan1*, GUO Yu-rong2, ZHANG Hai-tao1, SUN Zi-ding1,WANG Zhi-chao1

(1.College of Biological Engineering, Qilu University of Technology, Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering, Ji'nan 250353, China; 2.College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi'an 710062, China)

TheTropicalcandidaY-14 is mutagenized by atmospheric and room temperature plasma (ARTP). The optimal mutation condition is 150 s at 120 W, under such condition, the lethality rate is 96%. The strain Y-117 with high-yield xylitol is screened from mutagenizedTropicalcandida. The xylitol productivity of Y-117 is increased by 30.4% comparing withTropicalcandidaY-14. The single factor experiment is utilized combining with response surface methodology to optimize the fermentation conditions for strain Y-117. The fermentation conditions of Y-117 are optimized as follows: initial xylose content is 105 g/L, temperature is 30.5 ℃, and shaker speed is 190 r/min. Under these conditions, the xylitol productivity of Y-117 is 76.45 g/L, which is 42% higher than the starting strain.

xylitol;Tropicalcandida; plasma mutation; response surface method

2016-06-26 *通讯作者

农业部现代农业生产技术体系建设项目(CARS-28)

周龙霞(1989-)，女，山东临沂人，硕士，研究方向：微生物酶技术；

王燕(1961-)，女，山东济南人，教授，博士，研究方向：微生物酶技术和生物活性产品的分离等。

TS245.8

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.001

1000-9973(2016)12-0001-06