子宫平滑肌中缝隙连接变化及CX43表达与子宫收缩乏力性产后出血关系的研究

黄科华 颜建英 林顺和 余爱丽

子宫平滑肌中缝隙连接变化及CX43表达与子宫收缩乏力性产后出血关系的研究

黄科华 颜建英 林顺和 余爱丽

目的 研究子宫平滑肌组织中缝隙连接（Gap junctions，GJs）数量变化及连接蛋白（Connexin，CX）43表达与子宫收缩乏力性产后出血的关系。方法 采用1∶1病例对照研究方法，选择在我院行择期剖宫产产妇60例（宫缩乏力性产后出血者及同期无产后出血者各30例）。采用透射电镜定量检测产妇子宫下段平滑肌组织中GJs数量变化。分别采用RT-PCR技术及蛋白免疫印迹（Western blotting）技术检测子宫下段平滑肌组织中CX43mRNA及其蛋白表达水平。结果 子宫收缩乏力性产后出血组产妇子宫下段平滑肌组织中GJs数量及CX43mRNA及其蛋白表达水平均小于无产后出血组，差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论 子宫下段平滑肌组织中GJs数量减少、CX43表达降低与子宫收缩乏力性产后出血发病密切相关。

缝隙连接；连接蛋白43；产后出血

产后出血是导致孕产妇死亡最主要的产科并发症，子宫收缩乏力是产后出血最重要的病因。子宫收缩以电传导为基础，有研究者认为子宫肌细胞间的动作电位通过GJs，以局部电流的方式传递。细胞间的GJs是由CX组成，既往研究［1］发现有多种连接蛋白存在于子宫平滑肌组织中，其中CX43表达较丰富，并与分娩发动及产程调节等密切相关。该研究通过检测子宫收缩乏力性产后出血产妇子宫下段平滑肌组织中缝隙连接数量的变化、CX43的基因及蛋白表达水平，从而探讨其与宫缩乏力性产后出血发病的关系。

1 资料与方法

1.1 资料来源与分组

选择60例在我院行子宫下段剖宫产的产妇，剖宫产指征为胎位异常、脐带因素、羊水过少、社会因素。其中30例子宫收缩乏力性产后出血产妇为病例组，另30例无产后出血宫缩正常产妇为对照组。两组产妇的年龄、孕周、分娩次数、凝血功能指标水平等差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1、表2。由子宫收缩乏力所引起的产后出血诊断标准参照第八版《妇产科学》［2］，采用称重法测量产后出血量。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 所有标本采集及研究均经我院伦理委员会批准并征得患者知情同意。在剖宫产术中，胎儿娩出后切取少许子宫下段切口上缘平滑肌组织，其中切取1 mm3用于检测GJs数量，另取1.0～2.0 g用于检测CX43蛋白及mRNA水平。

1.2.2 采用透射电镜检测子宫平滑肌中GJs 将3%戊二醛固定后的子宫平滑肌组织块，50%～100%酒精逐级脱水，环氧树脂812和815混合包埋剂包埋，莱卡UC6 超薄切片机切片，铀铅染色后，用Tecnai G2 Spirit电子透射电镜5 800倍下进行观察。

1.2.3 采用RT-PCR方法测定子宫平滑肌组织中CX43mRNA表达水平 CX43基因引物和探针均委托大连宝生物工程有限公司设计和合成。由TaKaRa公司提供试剂，采用 2-△△CT方法进行相对定量分析。

1.2.4 采用Western blot法测定子宫平滑肌组织中CX43蛋白表达水平 结果计算：蛋白表达的相对量=目的蛋白IOD值/内参的IOD值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0软件包进行统计学处理，以（均数±标准差）表示计量资料，采用成组t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫平滑肌组织中GJs数量的比较

病例组子宫平滑肌组织中缝隙连接数量为（3.35±2.57）个，对照组为（6.12±3.98）个，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 子 宫平滑肌组织中CX43蛋白及CX43mRNA表达量的比较

表1 两组产妇的一般情况比较

表1 两组产妇的一般情况比较

注：与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0．05）

27．92±3．80 25．61±3．01分组 年龄（岁） 孕周（周） 分娩次数 BMI（kg/m2）病例组对照组28．73±2．95 27．77±3．29 39．30±1．48 39．72±0．96 0．80±0．55 0．68±0．61

表2 两组产妇出凝血相关指标的检测结果比较

表2 两组产妇出凝血相关指标的检测结果比较

注：与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0．05）

4．15±0．84 4．37±0．41分组 PLT（×109/L） PT（s） INR APTT（s） TT（s） Fib（g/L）病例组对照组213．50±49．15 226．22±53．31 12．26±0．64 11．99±0．72 0．92±0．05 0．89±0．06 33．67±2．87 32．69±2．46 16．29±0．83 16．34±0．73

图1 病例组及对照组子宫平滑肌中GJs定量情况

图2 子宫平滑肌组织中β-actin及CX43蛋白Western blotting测定结果

CX43蛋白及CX43mRNA在两组子宫平滑肌组织中的表达水平见表3、图2，病例组CX43蛋白及CX43mRNA定量均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 GJs在子宫平滑肌收缩中的作用

GJs［3］是相邻的细胞之间形成的亲水性管道，由连接蛋白（CX）组成的相邻两个连接子对合而成，不仅起着机械连接作用，更重要的是允许小分子物质、第二信使及离子在相邻细胞间自由交换，还通过电偶联和化学偶联的方式介导细胞间电和化学信号传递。本研究显示子宫收缩乏力组子宫肌层中GJs数量少于子宫收缩正常组。这与国外相关研究结果类似，如：既往研究［4］通过定量检测鼠子宫平滑肌组织中的GJs，发现分娩前非收缩子宫肌节中比分娩后收缩子宫肌节含有更多的GJs。妊娠终末期及分娩期子宫肌层中GJs较妊娠早期数量增加，体积增大，可使相邻的子宫平滑肌细胞胞浆互通，细胞间偶联加强，提供低电阻通路，从而使子宫肌层收缩增强。

有多种因素可通过影响连接子开放状态来调节GJs的功能，如：细胞内的pH降低同时伴随着GJs减少，若子宫肌处于缺氧状态，子宫肌细胞内酸性物质增多，可发生酸中毒致连接子闭合，GJs减少，从而导致子宫收缩乏力。子宫肌细胞内外的Ca2+等也可影响连接子的开放调节GJs通道的功能［5］，因此临床上发生子宫收缩乏力时可通过增加血清钙浓度来促进子宫收缩。此外，研究还发现对子宫的机械性牵张刺激亦能使子宫肌细胞膜上的GJs数量增加。但GJs的功能受CX的数量及活性直接影响［6］，且CX的磷酸化和去磷酸化可决定GJs通道的通畅性。

3.2 子宫平滑肌中CX43mRNA及蛋白表达与宫缩乏力性产后出血的关系

由于CX43mRNA及蛋白在子宫下段的表达量大于子宫体部，该研究收集子宫下段剖宫产切口上缘的平滑肌组织进行研究。结果发现宫缩乏力组子宫下段平滑肌组织中CX43mRNA和蛋白表达水平均低于宫缩正常组。提示CX43的表达水平可能与宫缩乏力性产后出血相关。CX43对子宫收缩性的调节可能主要与GJs的数量和功能状态相关。但研究［7］还发现CX43能影响游离型谷氨酸受体、水通道蛋白、囊性纤维化跨膜转运调节因子等，并与之相互作用发挥功能。

CX43在未妊娠妇女子宫平滑肌组织中无明显表达，在妊娠早期子宫肌中低表达，在临近足月时逐渐增加，临产时开始大量合成，分娩发动时迅速装配成GJs。国内外学者研究人类和鼠的子宫平滑肌，发现CX43在早产和足月产时表达都显著增加，但其表达量相比较无明显差异。Tong等研究［8］发现鼠子宫平滑肌中的CX43基因功能丧失可使平滑肌细胞间偶联受损，导致产程延长。以上研究均表明CX43在与子宫平滑肌收缩相关的一系列过程中起重要作用， 而GJs是CX43发挥功能的主要结构载体，改变子宫平滑肌中GJs的数量及功能状态直接影响肌细胞之间动作电位的传递速度，密切调节子宫平滑肌的收缩功能。

子宫平滑肌组织中CX43的表达受所中因素调节。国内外有研究［9］发现CRH、雌孕激素、PKC活化因子等都可通过转录因子Jun和Fos的调控而调节CX43mRNA和蛋白的表达。此外，前列环素能通过cAMP/PKA信号途径促进CX43蛋白的表达，内源性一氧化氮（NO）抑制CX43的表达。Mendelson［10］等认为，活化的核转录因子κB以及炎症反应均可促进CX43的表达。由此推测，上述激素或因子在子宫收缩乏力性产后出血产妇体内可能存在异常，可能通过调节CX43表达来影响子宫平滑肌收缩，对以上因子的研究将可能为宫缩乏力性产后出血的防治提供新的思路。

总之，CX43在子宫收缩乏力性产后出血的发生发展中起着不可或缺的作用，该机制可能为CX43表达降低使GJs形成减少以及功能受损，或通过调控其他跨膜转运因子及通道蛋白等途径调节子宫平滑肌的收缩。了解GJs及CX43在宫缩乏力性产后出血中的作用及机制对产后出血的防治有重要理论指导意义。

表3 子宫平滑肌组织中CX43、CX43mRNA表达水平

表3 子宫平滑肌组织中CX43、CX43mRNA表达水平

注：与同期对照组比较，*P＜0．05

0．72±0．33*1．09±0．69分组 例数 CX43 CX43mRNA病例组对照组30 30 0．08±0．02*0．12±0．05

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Significance of Gap Junctions Quantity and Connexin43 Expression in Myometrium of Parturient Women in Postpartum Hemorrhage

HUANG Kehua YAN Jianying LIN Shunhe YU Aili
Department of Obstetrics and Gynecology，Fujian Provincial Maternity and Children’s Hospital of Fujian Mediclal University，Fuzhou Fujian 350001，China

Objective To discuss the significance of gap junctions and connexin 43 in the pathogenesis of postpartum hemorrhage（PPH）caused by uterine atony． Methods A case-control 1:1 observational study was conducted． 60 cases of elective cesarean section were selected in our hospital（the same period of uterine atony postpartum hemorrhage without postpartum hemorrhage in 30 cases）． Transmission electron microscopic was used to detect the quantity of gap junctions． RT-PCR was used to detecte the level of CX43 mRNA in myometrium，western blotting was used determined the CX43 protein level． Results The number of GJs and the expression of CX43mRNA and protein in the smooth muscle of lower uterine segment of postpartum hemorrhage group were lower than those without postpartum hemorrhage, the difference was statistically significant（P＜ 0．05）． Conclusion The expression of CX43 and quantity of gap junctions in myometrium are lower than that of their controls，and there is close correlation between expression and contractile function． Decreases of gap junctions and lower exprssion of CX43 in myometrium may be closely related to atony PPH．

Gap junctions，Connexin43，Postpartum hemorrhage

R714．7

A

1674-9316（2016）23-0040-04

10．3969/j．issn．1674-9316．2016．23．020

福建省科技计划重点项目（2009Y0008） 基金项目：福建省医学创新课题（2009-CXB-32）

福建医科大学附属福建省妇幼保健院妇产科，福建 福州 350001 通讯作者：颜建英，E-mail：86031755@qq．com