MUC5AC在Barrett食管及食管腺癌中的表达及调控

索文昊 庄严阵 张海萍

MUC5AC在Barrett食管及食管腺癌中的表达及调控

索文昊 庄严阵 张海萍

目的 Barrett食管是正常食管向食管腺癌进展的重要中间阶段，本研究将分析MUC5AC在Barrett食管向食管腺癌进展过程中的作用，及其调控机制。方法 通过分析对比GEO数据库中Barrett食管和食管腺癌基因芯片，寻找差异基因，通过Western Blot，RealtimePCR等方法检测MUC5AC的表达及P38-MAPK通路对MUC5AC的调控机制。结果 食管腺癌MUC5AC mRNA水平相对Barrett食管中的mNRA水平下降86倍，而MUC5AC的表达受到P38-MAPK通路的调控，食管腺癌中GRS-1相对Barrett食管相对升高17倍，该蛋白抑制了P38活性，下调了MUC5AC的表达。结论 MUC5AC表达下降是食管腺癌发生的重要因素，其机制可能是GRS1抑制P-38活性，通过MAPK通路下调MUC5AC表达，促进了Barrett食管向食管腺癌进展。

Barrett食管；食管腺癌；MUC5AC；GRS-1；P38；MAPK

Barrett食管（Barrett’s Esophagus，BE）是由于慢性胃食管反流引起食管的肠上皮化生，导致食管下段复层鳞状上皮被柱状上皮代替的病理现象［1］，近年食管腺癌（Esophagus Adenocarcinoma，EA）发病率逐渐升高，其发生与Barrett食管关系密切［2］，Barrett食管成为公认的食管腺癌的癌前病变［3］。黏蛋白（Mucin）是覆盖在上皮组织表面的黏液的主要成分，目前发现的粘蛋白有20余种，在肿瘤发生过程中，黏蛋白可影响肿瘤细胞的黏附力、免疫识别、转移和预后［4-5］。正常食管粘膜鳞状上皮表达MUC1和MUC4，Barrett食管表层柱状上皮强烈表达MUC5AC［6］，我们发现Barrett食管伴有重度异型增生及食管腺癌的上皮中MUC5AC的表达下调，但MUC5AC调控机制尚不清楚，我们因此推测由于MUC5AC表达下调，Barrett食管无法获得保护，受到长期刺激后更容易进展为食管腺癌。Barrett食管是正常食管向食管腺癌进展的重要中间阶段，探讨其发生发展的具体机制对临床防治Barrett食管及阻止其向食管腺癌方向进展具有积极的意义。

1 材料与方法

1.1 GEO数据分析

在GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中检索Barrett食管及食管腺癌，选择GSE26886［7］进行数据分析，该芯片包含正常食管粘膜，Barrett食管及食管腺癌患者的冰冻组织，应用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array进行全基因组表达谱检测，我们选取样本GSM661731，GSM661732，GSM661733，GSM661734，GSM661737，GSM661739为 BE组，选取GSM661743，GSM661745，GSM661749，GSM661752，GSM661753，GSM661756，GSM661758，GSM661761为EA组，利用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/及http://www.kegg.jp/在线工具进行进一步分析。

1.2 细胞培养

Barrett食管细胞系：CP-B细胞，食管腺癌细胞BIC-1均购自ATCC（American Type Culture Collection），上述细胞置于含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。

1.3 Western Blot检测蛋白表达

裂解细胞后，提取蛋白质并定量，制备10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳，转膜，封闭，用P38，P-P38，β-Tublin一抗工作夜（1：1 000稀释）、HRP标记的二抗工作液（1：5 000稀释）孵育，用增强型化学发光试剂（EC L）显影并拍照。

1.4 RGS1的干扰与检测

针对RGS1的siRNA干扰序列（见表1）及阴性对照Scramble序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。将BIC-1细胞分为对照组和RGS1干扰组，分别转染Scramble siRNA及干扰siRNA。48 h后提取mRNA，用Realtime PCR检测RGS1基因表达，PCR引物（见表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 RGS1基因的干扰序列和检测引物

1.5 统计学方法

用SPSS 13.0软件进行统计分析，多组间均数差异性比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及LSD检验。P＜0.05，表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GEO数据库分析，MUC5AC mRNA在食管腺癌中表达显著降低

我们对GSE26886［7］进行分析，对比EA和BE组mRNA，二者存在差异基因9 670个（见图1），其中最为差异最为显著的10个基因为见表2，其中MUC5AC mRNA 在食管腺癌组织中相对于Barrett食管mRNA低86倍。

2.2 MAPK通路在Barrett食管和食管腺癌中发挥了关键作用

通过分析基于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库中信号通路的上下游关系，构建了相关信号通路之间的相互作用关系网络图，我们发现MAPK信号通路是BARRETT食管和食管腺癌中最为核心的信号通路（见图2）。

2.3 MUC5AC蛋白受到P38-MAPK信号通路调控

CP-B和BIC-1分别分为对照组和实验组，对照组加入DMSO，而实验组加入P38抑制剂SB203580（25 µmol/L），通过Western blot检测，我们发现CP-B细胞和BIC-1细胞中P38、 P-P38的表达受到SB203580的抑制，而MUC5AC的表达也下降（见图3），说明MUC5AC的下调受到了P38-MAPK信号通路调控。

图1 Barrett食管和食管腺癌mRNA表达差异基因（Q＜0．05，P＜0．02，倍数＞1．2）

图2 基因信号通路网络图，B为A局部放大图，MAPK信号通路是核心信号通路

图3 用DMSO和SB203580分别处理CP-B细胞和BIC-1细胞

2.4 RGS1抑制P38-MAPK通路

Barrett食管的发生通常与反流性食管炎相关［8］，炎症刺激会激活MAPK通路，促进激活黏蛋白分泌粘液，但是在食管腺癌发生过程中这一过程被抑制，而调控机制尚不清楚，进一步分析，我们发现RGS1参与了该过程（见表2），食管腺癌组织中RGS1较Barrett食管组升高，我们合成了针对RGS1基因的干扰序列和PCR引物（见表1），将RGS1 siRNA及对照siRNA（NC）转染BIC-1细胞，通过Realtime PCR方法检测，RGS1 RNA表达下降（见图4）。

食管腺癌细胞BIC-1分为3组，分别是WT、NC和siRGS1组，NC组转染Scramble序列，siRGS1转染针对RGS1的siRNA，转染48 h后提取总蛋白，通过Western Blot检测，发现siRGS1组P38，P-P38，MUC5AC蛋白相对对照组升高（见图5）。

表2 Barrett食管和食管腺癌mRNA表达差异基因

图4 食管腺癌细胞BIC-1转染siRNA，RGS1基因表达下降注：*表示P＜0．05

3 讨论

黏蛋白（Mucin）是覆盖在上皮组织表面的黏液的主要成分，在肿瘤发生过程中，黏蛋白可影响肿瘤细胞的黏附力、免疫识别、转移和预后［9］。正常食管黏膜鳞状上皮表达MUC1和MUC4，而BARRETT食管表层柱状上皮强烈表达MUC5AC，腺体表达MUC6［6］，我们的研究表明BARRETT食管伴有重度异性增生及食管腺癌的上皮中MUC5AC的表达下调，正是这一改变可能使正常的保护、调节黏膜分化的功能受到影响，从而导致肿瘤的发生。

我们的研究发现P38-MAPK通路是参与MUC5AC调控的重要信号通路，P38-MAPK信号途径是MAPKs家族中的重要组成部分，是细胞间信号传导通路的作用途径之一［10］，它在外界各种刺激条件的作用下，活化为磷酸化P38（P-P38）参与细胞内凋亡、分化、炎症、应激［11-12］等，我们发现在Barrett食管及食管腺癌细胞中抑制P38的表达，MUC5AC表达水平下降，说明MUC5AC受到P38-MAPK通路调控。Barrett食管的发生通常与胆汁反流相关，炎症刺激常常会激活MAPK通路，可以通过激活黏蛋白促进细胞分泌粘液，从而保护黏膜组织，但是在食管腺癌发生过程中这一过程却被抑制，通过分析，我们发现在食管腺癌中RGS1表达明显上调，该蛋白通过抑制p38-MAPK通路降低了MUC5AC的表达，从而使得食管粘膜无法获得保护，在长期刺激下导致肿瘤的发生。

图5 BIC-1转染针对RGS1的siRNA

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Expression and Regulation of MUC5AC in Barrett’s Esophagus and Esophagus Adenocarcinoma

SUO Wenhao ZHUANG Yanzhen ZHANG Haiping
Department of Pathology，The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen Fujian 361003，China

Objective Barrett's esophagus is an important intermediate stage in the development of esophageal adenocarcinoma． In this study，the role of MUC5AC in esophageal adenocarcinoma was analyzed and regulation mechanism of MUC5AC was studied． Methods The differentially expressed genes of Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma were performed by analyze microarray in GEO datasets． The expression of MUC5AC expression and the regulation of MUC5AC through P38-MAPK pathway were detected by Western Blot and RealtimePCR． Results The expression of MUC5AC mRNA in esophageal adenocarcinoma was 86-fold lower than that in Barrett's esophagus． The expression of MUC5AC in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma cells was regulated by P38-MAPK pathway． The expression of GRS-1 in esophageal adenocarcinoma was 17 times higher than that in Barrett's esophagus，the protein inhibited the P38 activity，and down-regulated the expression of MUC5AC． Conclusion The down-regulation of MUC5AC expression is an important factor in the occurrence of esophageal adenocarcinoma． The mechanism may be that GRS1 inhibits P38 activity and down-regulates MUC5AC expression through MAPK pathway，which promotes the progression of Barrett's esophagus to esophageal adenocarcinoma．

Barrett’s esophagus，Esophagus adenocarcinoma，MUC5AC，GRS-1，P38，MAPk pathway

R361

A

1674-9316（2016）23-0165-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2016．23．091

福建省卫生计生委青年科研课题（编号：2014-2-64）

基金项目：福建省自然科学基金项目（编号：2015J01562）

厦门大学附属第一医院病理科，福建 厦门 361003

▲ 通讯作者：张海萍，E-mail：zhp3398@163．com