水稻基腐病菌flhDC和fliA基因的功能

陈雪凤，余成鹏，刘琼光

（华南农业大学农学院/广东省微生物信号与作物病害重点实验室，广州510642）

水稻基腐病菌flhDC和fliA基因的功能

陈雪凤，余成鹏，刘琼光

（华南农业大学农学院/广东省微生物信号与作物病害重点实验室，广州510642）

【目的】水稻细菌性基腐病（致病菌Dickeya zeae）是水稻重要细菌病害之一。细菌的鞭毛是重要的运动器官，迄今有关水稻基腐病菌的鞭毛系统、flhDC和fliA基因功能及其调控机理尚不清楚，明确这些鞭毛基因的功能，有利于进一步了解D. zeae的致病性综合调控网络、开发新型药物作用靶标以及制定病害防控策略。论文旨在明确D.zeae鞭毛系统中flhDC和fliA在致病性中的作用。【方法】以D. zeae野生型致病菌株EC1基因组DNA为模板，设计一系列引物，PCR扩增待敲除的目标基因flhDC和fliA各自的上、下游片段，再以混合的上、下游片段为模板，扩增得到缺失flhDC和fliA的融合片段，双酶切纯化后连接到自杀性载体pKNG101上，构建带有反向筛选标记基因sacB的自杀重组质粒pKNG-ΔflhDC和pKNG-ΔfliA，通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中，通过两次等位基因同源重组，PCR检测和测序验证，最终获得目标基因flhDC和fliA缺失突变体ΔflhDC和ΔfliA；测定并比较突变体与野生菌的胞外酶活性、毒素活性、运动性、生物膜形成能力，以及对水稻的致病力和对烟草的过敏性反应（HR）；进一步提取细菌总RNA，以16SrDNA为内参来校正目标基因的表达量，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法，比较野生菌和突变体ΔflhDC和ΔfliA下游基因flhD、flhC、fliA和fliC的表达量差异。【结果】通过基因操作手段成功构建了基因缺失突变体ΔflhDC和ΔfliA。……