柑橘全爪螨PcSOD3的异源表达及其重组酶的抗氧化活性

蒋红波，冯英财，刘世火，王进军

（1西南大学植物保护学院，重庆400715；2重庆出入境检验检疫局，重庆400020）

柑橘全爪螨PcSOD3的异源表达及其重组酶的抗氧化活性

蒋红波1，冯英财2，刘世火1，王进军1

（1西南大学植物保护学院，重庆400715；2重庆出入境检验检疫局，重庆400020）

【目的】笔者课题组前期研究发现，柑橘全爪螨在极端温度、杀螨剂、重金属和紫外线胁迫下，其体内PcSOD3表达显著上调，暗示PcSOD3在柑橘全爪螨应对不良环境胁迫的过程中起着至关重要的作用。为了进一步明确 PcSOD3的生理功能，本研究开展了该基因的异源表达及重组酶生化特性的分析工作。【方法】构建pET28a-PcSOD3重组表达质粒，并在大肠杆菌中实现异源表达。随后利用镍柱亲和层析法分离纯化PcSOD3重组酶，采用Western blot对纯化蛋白进行验证。使用WST-1法分析PcSOD3重组酶的抗氧化活性，测定不同反应体系pH及不同前处理温度下PcSOD3重组酶的活性。采用氯化铬、叔丁基过氧化氢和过氧化氢异丙苯3种氧化性药剂，诱导大肠杆菌细胞内产生氧化应激反应，并利用Kirby-Bauer纸片琼脂糖扩散法测定上述3种药剂对过表达PcSOD3大肠杆菌的抑制效果。【结果】在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中成功表达PcSOD3，研究摸索出PcSOD3重组蛋白最适诱导表达条件：诱导表达温度为18℃，摇床转速为160 r/min，当OD值达0.6时加入IPTG并使其终浓度为0.4 mmol·L-1，诱导时间为18 h。Western blot验证结果表明所纯化重组蛋白即为PcSOD3重组酶，重组蛋白大小为25.3 kD。WST-1法测得PcSOD3重组酶活性在pH=7.0的反应体系中最高，约为47.3 U/mg protein，而在前处理温度为25℃时，PcSOD3重组酶活性最高为40.2 U/mg protein。利用K-B纸片琼脂糖扩散法进行了药敏试验，结果显示氯化铬对过量表达PcSOD3大肠杆菌产生的抑菌圈均显著小于对空载体对照产生的抑菌圈，通过测量发现抑菌圈较对照缩小近20%；……