双光子显微镜在小动物活体光学成像中的研究进展①

张文豪，李建军，杨德刚，杨明亮，杜良杰，高峰，刘长彬，李大鹏，胡安明，蔡畅

双光子显微镜在小动物活体光学成像中的研究进展①

张文豪1,2a,3,4，李建军1,2a,3,4，杨德刚1,2a,3,4，杨明亮1,2a,3,4，杜良杰1,2a,3,4，高峰1,2a,3,4，刘长彬1,2a,3,4，李大鹏1,2a,3,4，胡安明1,2b，蔡畅1,2a,3,4

双光子显微镜结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术。双光子荧光显微镜具有光损伤小、漂白区域小、穿透能力强、高分辨率、荧光收集率高、图像对比度高、可实现暗场成像、适合多标记复合测量等多种特点，可应用于小动物活体光学成像，在肿瘤免疫治疗、基因治疗、干细胞研究、药物筛选与评价、活体脊髓损伤成像等领域研究中有广泛应用。

双光子显微镜；活体光学成像；小动物；综述

[本文著录格式] 张文豪，李建军，杨德刚，等.双光子显微镜在小动物活体光学成像中的研究进展[J].中国康复理论与实践, 2017,23(1):37-41.

CITED AS:Zhang WH,Li JJ,Yang DG,et al.Research progress of two-photon microscopy in small animals in vivo imaging(review)[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(1):37-41.

1931年，Maria Göppert-Mayer在博士论文中第一次提出原子或分子双光子激发的理论假设。20世纪60年代初，Kaiser、Garret以及Abella等利用当时刚发明的激光技术，在晶体中观察到双光子吸收现象。1976年，Berns第一次报道活细胞中的双光子效应。1990年Denk等将双光子激发现象应用到激光共聚焦扫描显微镜中，制造出双光子激光共聚焦显微镜[1]。相对于其他成像技术，如超声(ultrasound)、计算机断层(computed tomography,CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、正电子衍射断层(positron-emission tomography, PET)、单光子衍射计算机断层(single-photon-emission computed tomography,SPECT)等技术，活体光学成像具有许多独特的优点：操作简便、结果直观、测量快速、灵敏度高以及费用低廉等[2]，尤其是可在活体内实现对分子事件的动态、实时、连续监测，并且能够揭示生物分子相互作用过程的时间、空间关系[3-11]。

活体动物光学成像(in vivo optical imaging)主要采用生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence)两种技术[12-15]。生物发光主要用荧光素酶(luciferase)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记[16-18]。相对于传统的单光子成像，双光子成像在生物厚组织，如活体脑组织成像中具有较高的空间分辨率、信噪比以及较低的组织损伤性等优势。近年来，双光子荧光显微镜(two-photon fluorescence microscopy,TPM)在医学领域得到广泛应用[19-21]。TPM使用红外波段的超快激光作为光源，利用光学非线性效应实现对样品的三维、四维甚至实时监测[22-23]。由于红外光对生物组织的杀伤作用相对较小，因此可利用此技术对生物样品进行活体动态观察；同时由于长波长激光在组织中具有很高的穿透深度，双光子荧光成像具有成像深度大的特点[24]。TPM对生物样品成像具备光漂白性小、光毒性小、穿透性强等优点，一经问世即很快应用于活体动物医学领域的研究中，尤其适用于对小动物模型(如斑马鱼、果蝇、小鼠、大鼠)进行长时间内反复多次动态活体成像[25-30]。TPM已成为现代生命科学研究的重要工具，并带来革命性的变化。本文重点综述TPM在小动物活体光学成像中的研究应用。

1 成像原理

传统激光共聚焦显微镜有两大局限。①光漂白现象：因为共聚焦的针孔必须足够小，以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强，以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程变得越来越弱。②光毒性作用：在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度，以保持样品活性。光漂白和光毒现象很大程度限制了活性样品的研究，尤其是动态观察活性样品生长、发育过程的各个阶段[31-32]。

荧光显微技术的发展经历了从定性到定量、从二维到三维成像的过程，即从传统荧光显微镜(fluorescence microscope, FM)到以单光子激光共焦扫描显微镜(single-photon laser con-focal scanning microscope,SPLCSM)为代表的空间分辨荧光显微技术的发展。FM收集的是样品的整体荧光，无法获得准确的定位和定量信息。该技术采用场光源，难以区分样品内不同部位的荧光信号，也难以再现样品内荧光物质的原有存在状态。由于FM是二维成像，较厚样品切片后无法观察活体样品内荧光物质的动态变化过程。

双光子激发的基本原理是[33-34]，在高光子密度下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过很短时间，即所谓激发态寿命后，发射出一个波长较短的光子。其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子相同。由于双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，TPM使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100 fs，而频率可达80～100 MHz。

TPM结合了SPLCSM和双光子激发技术。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处光子密度最高，双光子激发只发生在物镜焦点上；观察标本时，只在焦平面上才有光漂白和光毒性。双光子的吸收现象也是非线性效应，激发只发生在物镜焦点上，所以TPM不需要共聚焦针孔，提高了成像亮度和信噪比[35]。

2 成像特点

双光子吸收率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度。双光子吸收截面很小，只有在具有很大光子流量的区域，荧光团才会被激发。因此所用激光器多为钛激光器，可以达到ps或fs级的扫描速度，且具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或消除光漂白和光毒作用带来的不利影响。而在一个很小的范围提供高密度光子，保证了双光子的同时激发。

双光子激发过程如下。在激光照射下，基态荧光原子或分子同时吸收两个光子而成激发态。如还原型烟酰胺腺嘌岭二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide H,NADH)酶，在单光子激发时，在350 nm光的激发下产生450 nm荧光；而在双光子激发时，可采用温和的红外或近红外光，如750 nm激光下得到450 nm荧光。这既避免了紫外光对样品的伤害和使用紫外光学元件的许多限制，又可延长对活体生物样品的观察时间，为研究氨基酸、蛋白质和神经递质等提供了独特而重要的方法[33-34]。

SPLCSM在FM技术基础上加装激光扫描，可在连续、固定范围内进行小功率扫描，记录动态变化，共轭聚焦装置可获得清晰图像[36]。光路中两个共焦小孔的设置消除了焦平面以外杂散光的干扰，提高了分辨率和成像质量。该技术实现了荧光物质在亚细胞水平的定位，可无损伤地对较厚样品逐层连续扫描，并重构其组织或细胞的三维立体结构。虽然SPLCSM克服了FM技术的部分不足，但仍有一定的不足：①激光能光漂白荧光物质，共焦小孔在阻挡焦平面外杂散光的同时亦阻挡了部分本应该接收到的来自焦平面的光；为了获得足够的信噪比，需要很强的激发光，荧光信号也会随着扫描进程而变得越来越弱；②许多荧光染料分子在激光照射下会产生细胞毒素，限制了扫描时间和激光光源的强度；③由于细胞成分散射，短波长的激发光不易穿透标本。

将双光子技术与各种显微镜技术相结合，在生物医学领域的应用中更能发挥其潜力。与SPLCSM相比，TPM具有以下优点：①具有高空间局域性和高分辨率；②双光子荧光远离激发波长，避免了激发光对荧光探测的影响，能实现暗场成像，散射产生的背景噪声小，图像对比度高；③焦点以外不发生漂白现象；④可用红外或近红外激光作为光源，红外光在生物组织中穿透力强，能对生物组织的深层成像观察。

3 主要应用领域

近年来，随着活体光学成像设备的进展以及转基因动物研究的兴起，国内外科研机构已经将小动物活体光学成像技术广泛应用于肿瘤免疫治疗、基因治疗、干细胞研究、药物筛选与评价、活体脊髓损伤成像等领域，并取得许多成果[37-39]。

3.1 活体监测肿瘤的生长与转移

传统肿瘤研究方法主要局限于肉眼观察、处死动物后进行大体解剖或组织学观察等，无法动态观察整个肿瘤事件。利用TPM研究肿瘤细胞凋亡具有独特优点，可避免由于处死动物而造成的组间差异，节省动物成本，并能动态监测肿瘤在体内的生长和转移，使分子水平的研究能在更接近活体的环境中进行，可以作为细胞分析的完整应用工具[40-41]。

实时进行高清晰度荧光成像，TPM低光漂白和光毒性扫描和检测技术最大限度地减少光对活细胞的伤害；能直接快速地测量各种癌症模型中肿瘤的生长和转移，并可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估；活体生物发光成像能够无创伤地定量检测小鼠整体原位瘤、转移瘤及自发瘤。

3.2 监测基因治疗中基因的表达

基因治疗包括在体内将一个或多个感兴趣基因及其产物安全而有效的传递到靶细胞。可应用荧光素酶基因作为报告基因用于载体的构建，观察目的基因是否能够在试验动物体内持续高效和组织特异性表达[42]。这种非侵入方式具有容易准备、低毒性及轻微免疫反应的优点。荧光素酶基因也可以插入脂质体包裹的DNA分子中，用来观察以脂质体为载体的DNA运输和基因治疗情况。

基因表达研究目的基因何时、何种刺激下表达。将荧光素酶基因插入目的基因启动子下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型[43]。利用其表达的荧光素酶与底物作用，产生生物发光，反应目的基因的表达情况，从而实现对目的基因的研究。

3.3 干细胞应用研究

干细胞光学标记的常用方法有：①利用萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)作为报告基因，通过转基因技术体外转染干细胞；②通过亲脂性荧光染料直接标记干细胞；③从已构建好的生物发光转基因动物中提取干细胞，所提取干细胞即具备生物发光特性。

总体来说，应用TPM成像技术进行干细胞研究主要集中于以下几个方面：①监测干细胞的移植、存活和增殖；②示踪干细胞在体内的分布和迁移；③多能诱导干细胞、肿瘤干细胞等新兴研究[44-50]。

3.4 药物的筛选与评价

药物先导化合物的筛选与评价通常处于药物发现和开发的瓶颈位置，基于现代分子生物学、细胞生物学技术以及现代仪器自动化技术产生的高通量筛选(high throughput screening, HTS)的快速发展，代表了现代发现药物先导化合物的主要趋势。HTS是指运用自动化筛选系统，在短时间内、在特定的筛选模型上，完成数以千计甚至万计的样品活性测试。TPM可提供靶基因在体内的实时表达和对候选药物的准确反应，还可以用来评估候选药物和其他化合物的毒性，为药物在疾病中的作用机制及效用提供研究方法[50-51]。

3.5 小动物活体脊髓成像

TPM能够对转基因荧光小鼠脊髓轴突、小胶质细胞、钙离子活性进行活体成像；能在长时间内观察脊髓损伤后轴突退变与再生、小胶质细胞聚集、钙离子的动态变化等脊髓损伤后细胞水平的活体成像，为理解和追踪脊髓损伤的病理生理过程奠定重要的理论基础[22,27,52-55]。Zhang等[56-57]应用TPM进行甲波尼龙对小鼠脊髓损伤效应的活体成像研究，并且进行了甲波尼龙治疗脊髓损伤时间窗的探讨性研究。

4 总结与展望

在过去二十多年里，TPM成像技术的应用范围迅速增加，使我们对活细胞生理、病理和药理领域的认识得到前所未有的进步[58]。

尽管TPM的应用越来越广泛，但仍有一些问题需要解决：①只能对荧光成像；②由于使用红外和近红外光源，样品可能会受到热损伤；③受昂贵的超快激光器限制，TPM的价格和维护成本还比较高。

该技术下一步发展可能涉及红外染料，因为其激发光波长更长，并能减少组织对光的吸收和折射，从而实现更深层组织的成像。随着激光成像技术、计算机成像技术、分子探针、荧光标记技术、高灵敏度探测技术、计算机图像处理等技术系统装备，以及医学应用等方面的飞速发展，TPM技术会得到更大提升和更广泛的应用。TPM将不仅用于基础研究和药物研发，也将可能会作为新技术扩展到临床检验及药物治疗领域。

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Research Progress of Two-photon Microscopy in SmallAnimals in Vivo Imaging(review)

ZHANG Wen-hao1,2a,3,4,LI Jian-jun1,2a,3,4,YANG De-gang1,2a,3,4,YANG Ming-liang1,2a,3,4,DU Liang-jie1,2a,3,4,GAO Feng1,2a,3,4,LIU Chang-bin1,2a,3,4,LI Da-peng1,2a,3,4,HU An-ming1,2b,CAI Chang1,2a,3,4
1.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,Beijing 100068,China;2.a.Department of Spinal and Neural Function Reconstruction;b.Department of Neurosurgery,China Rehabilitation Research Center,Beijing Bo'ai Hospital,Beijing 100068,China;3.Center of Neural Injury and Repair,Beijing Institute for Brain Disorders,Beijing 100068,China;4.Beijing Key Laboratory of Neural Injury and Rehabilitation,Beijing 100068,China

LI Jian-jun.E-mail:crrc100@163.com

Two-photon microscopy is a new technique which combines laser scanning con-focal microscopy and two-photon excitation technique.Two-photon fluorescence microscopy has the advantages of little light damage,small bleaching area,strong penetrability,high resolution,high fluorescence collection efficiency,and high image contrast.It is suitable for dark field imaging and multi-labeled compound measurement,and has been widely used in small animals in vivo optical imaging,such as research for tumour,gene therapy,stem cells,drug development,spinal cord injury,etc.

two-photon microscopy;in vivo optical imaging;small animals;review

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.01.09

R446.8

A

1006-9771(2017)01-0037-05

2016-10-19

2016-10-26)

1.国家自然科学基金项目(No.81272164)；2.中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(No.2015CZ-6)；3.中国康复研究中心课题(No.2012-1;No.2013-7)。

1.首都医科大学康复医学院，北京市100068；2.中国康复研究中心北京博爱医院，a.脊柱脊髓神经功能重建科；b.神经外科，北京市100068；3.北京脑重大疾病研究院神经损伤与修复研究所，北京市100068；4.北京市神经损伤与康复重点实验室，北京市100068。作者简介：张文豪(1991-)，男，汉族，河南柘城县人，硕士研究生，主要研究方向：脊柱脊髓损伤的康复与治疗。通讯作者：李建军(1962-)，男，汉族，教授，主任医师，博士研究生导师，主要研究方向：骨科及脊柱脊髓损伤的康复与治疗。E-mail:crrc100@163.com。