椎间盘突出患者骨髓血血清Th1、Th2、IL-12及IL-4的表达及临床意义

万锐杰 刘绍凡 徐敏敏 陈 愉

(重庆市中医院骨科，重庆 400000)

椎间盘突出患者骨髓血血清Th1、Th2、IL-12及IL-4的表达及临床意义

万锐杰 刘绍凡 徐敏敏 陈 愉

(重庆市中医院骨科，重庆 400000)

目的探讨Ⅰ型辅助性T细胞(Th1)、Ⅱ型辅助性T细胞(Th2)、白细胞介素(IL)-4和IL-12在椎间盘突出(LDH)患者骨髓血血清中的表达水平及其临床意义。方法选取该院2013年9月至2015年9月住院的腰椎骨折并摘除椎间盘的患者15例(对照组)及手术治疗LDH患者15例(观察组)，分别抽取两组骨髓血，分离骨髓血血清，流式细胞术用以检测骨髓血血清中Th1和Th2细胞数，酶联免疫吸附法(ELISA)用以检测IL-4和IL-12的表达。结果观察组骨髓血血清中Th1和Th2的细胞数高于对照组(P<0.05)，观察组骨髓血血清中IL-12的表达高于对照组(P<0.05)，而两组IL-4的表达差异无统计学意义(P>0.05)，观察组骨髓血血清中IL-12与IL-4的表达呈负相关(r=-0.320，P<0.05)。结论LDH患者血清中Th1和Th2细胞数增加，Th1分泌的细胞因子IL-12的表达增加，Th1及其分泌的细胞因子IL-12可能参与LDH疾病的发生发展。

椎间盘突出；Ⅰ型、Ⅱ型辅助性T细胞；白细胞介素

椎间盘突出(LDH)发病率高〔1〕。Ⅰ型辅助性T细胞(Th1)和Ⅱ型辅助性T细胞(Th2)同属于Th细胞亚群，白细胞介素(IL)-4是由Th2细胞分泌的细胞因子，IL-12是由Th1细胞分泌的细胞因子〔2〕。Th1和Th2细胞的平衡及IL-4和IL-12的表达水平与多种疾病的发生发展密切相关，包括哮喘〔3〕，免疫系统疾病〔4〕，脊髓炎〔5〕等，近年来有研究表明LDH患者髓核组织中Th1、Th2、IL-12和IL-4的表达与其发病有相关性〔6〕。本研究拟分析LDH患者骨髓血血清中Th1、Th2、IL-12和IL-4的表达及其临床意义。

1 材料与方法

1.1临床样本 选取重庆市中医院骨外科2013年9月至2015年9月住院的患者30例，其中15例腰椎骨折并摘除椎间盘的患者为对照组，15例手术治疗LDH患者为观察组，两组男均9例，女6例，年龄49～73〔平均(57.97±9.33)〕岁。纳入标准：经病理学检查，所有腰椎骨折并摘除椎间盘的患者其骨髓组织均正常，没有明显退行性病变，选取的LDH患者符合椎间盘退变的病理形态学改变。排除标准：影响神经或免疫系统功能的疾病，均无血液系统疾病或家族遗传病史，患者手术前均未接受任何药物或介入治疗。该实验的所有过程均遵从赫尔辛基宣言的标准，且研究方案均经本院医学伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2骨髓血血清的抽取 分别抽取两组患者的骨髓血2 ml，4℃保存，后续骨髓血血清的提取需迅速进行，分别将两组骨髓血血清样本从冰箱中取出，4℃度静置2 h，9 000 r/min离心10 min后，小心将上层血清吸出，转移至一干净的EP管中，2 ml骨髓血可提取的骨髓血血清量约500 μl。

1.3流式细胞术检测骨髓血血清中Th1和Th2细胞 按照人IL-4、IL-12的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(美国，美天妮公司)的说明书进行操作，将方法1.2中制备的骨髓血血清中加入组织多肽抗原(TPA)和离子霉素，3 h后收集。实验分为对照管和实验管，分别加CD3-活化蛋白(AP)C和CD8-PercP，混匀，室温放置20 min，加细胞裂解液，混匀，放置10 min，随后1 000 r/min离心5 min，弃上清。加Cytofix/Cytoper液，4℃放置20 min，加入Cytofix/Cytoperm液1 ml，1 500 r/min离心5 min，弃上清。实验管加入IL-4-PE和IL-12-PE，对照管加入相应抗体，4℃避光放置30 min。加Perm/Wash液洗涤两次，洗涤液重悬。FACScom软件和CD3-APC、CD8-PercP及IL-4-PE，IL-12-PE抗体标记细胞，调节仪器补偿，Cellquest软件分析细胞。其中区分细胞分别采用前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光散点图设门，CD3和CD8散点图设门区分Th细胞(CD3+CD8-)，用IL-12和IL-4的散点图表示Th1和Th2。该实验过程中用到的细胞表面标记抗体(抗人)CD3-APC，CD8-PercP，CD8-CYC，CD4-CYC，IL-4-PE，IL-12-PE，Cytofix/Cytoperm液、Perm/Wash液和FACS Lysing Solution均购于美国的BD公司。

1.4ELISA法检测骨髓血血清中IL-4和IL-12的表达 按照ELISA试剂盒说明书进行操作，稀释标准品，加样时分别设空白孔(不加酶标试剂)、标准孔、待测样品孔。分别为标准品50 μl加入酶标包被板，40 μl样品稀释液加入待测样品孔，待测样品10 μl，封板膜封板后37℃孵育3 min，30倍浓缩洗涤液蒸馏水稀释成1倍后备用，揭去封板膜，弃液体甩干，加洗涤液静置30 s，弃洗涤液，重复5次，甩干，加酶标试剂，每孔500 μl，空白孔，不加，37℃孵育3 min，洗涤液洗涤，加入显色剂(A液50 μl，B液50 μl，混匀)，37℃避光，显色15 min，每孔加50 μl终止液，终止反应，设置空白调零，450 nm波长下检测各孔的吸光度(OD值)，检测设备为LISA-STAR全自动酶标分析仪(瑞典，LISA-STAR公司)。以标准物浓度作为横坐标，OD值作为纵坐标，绘制成标准曲线，根据所测的样品OD值在标准曲线上查出相应浓度，乘以释倍数即为实际浓度即为两组患者的骨髓血血清中IL-4和IL-12的表达水平。

1.5统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验、线性相关性分析。

2 结 果

2.1两组骨髓血血清中Th1/Th2细胞的分布 观察组骨髓血血清中Th1和Th2的细胞数〔(13.14±3.07)%、(5.37±1.22)%〕高于对照组〔(3.67±1.23)%,(1.78±0.36)%;t=4.135,4.562,P=0.027,0.012〕。

2.2两组骨髓血血清中IL-4和IL-12表达比较 观察组骨髓血血清中IL-12的表达〔(20.16±4.37)pg/ml〕显著高于对照组〔(4.85±2.18)pg/ml,t=4.321,P=0.017〕，而两组IL-4的表达〔(1.65±1.21)pg/ml、(1.41±1.14)pg/ml〕差异无统计学意义(t=0.776,P=0.628)。

2.3观察组IL-12与IL-4相关性 观察组骨髓血血清中IL-12与IL-4的表达呈负相关(r=-0.320，P<0.05)。

3 讨 论

LDH是常见的腰部疾病之一，且个体之间常常因为存在性别、年龄、部位和时间的差异，而有不同的临床表现或症状，常表现为腰痛或麻痹症等症状，其发病人群一般为中老年人，但近来有逐渐从中老年人向青壮年人发展的变化趋势〔7〕。LDH以腰椎间盘退变为病理基础。研究显示，发生椎间盘突出的患者其细胞外基质(ECM)可发生明显的降解，其椎间盘细胞总数会显著降低，ECM发生降解，导致整个腰椎间盘的力学性能改变，使得腰椎间盘发生脱出或突出等症状，进一步引发腰椎间盘突出的各种临床症状〔8〕。其诱发因素有患者的职业、年龄、外伤、种族和妊娠等因素〔9〕。目前也有研究认为LDH的发生与遗传性、生物力学变化和细胞因子的表达异常等密切相关〔10〕。本研究显示，LDH的发病原因除了与机械性因素有关以外，还与炎性因子和免疫细胞有着密切的关系。Th1参与细胞的迟发型超敏反应或免疫反应等过程，能合成分泌细胞因子IL-12，但不能合成分泌IL-4，Th2则主要参与体液免疫应答等过程，能合成分泌细胞因子IL-4，不能合成分泌IL-12，IL-12为炎性细胞因子，发挥促进疾病的发生发展的作用，IL-4为抑制炎症的细胞因子，阻止疾病的发生发展〔11〕。由于IL-4和IL-12的表达反映了T细胞的活化程度，即LDH可使患者骨髓血血清中T细胞的活化程度增加。龚韶华等〔6〕在LDH患者的髓核组织中也发现了这一变化，可能原因是IL-12参与Th1的细胞活化，IL-4参与Th2的活化。Th1 型细胞因子为炎性细胞因子，促进疾病的发生发展，Th2型细胞因子IL-4则主要发挥抑制炎症的作用，阻止疾病的发生发展，缓解疾病。本研究结果也表明了Th1和IL-12 在LDH患者骨髓血血清中处于高表达状态，参与LDH疾病的发生发展。

1乔晓峰，李长德，解云川，等.腰椎间盘突出症患者髓核组织TNF-α、IL-8以及IL-10的表达及其意义〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(17)：4276-7.

2曹 涌，姚 羽，张 烽.腰椎间盘突出症与Th细胞、NK细胞的相关性研究〔J〕.中国脊柱脊髓杂志，2013；23(10)：912-5.

3Chen X，Rao SQ，Gao BH，etal.Effect of early vitamin D supplementation on asthma and the possible mechanisms〔J〕.Genet Mol Res，2015；14(4)：14136-43.

4Dhakal M，Miller MM，Zaghouani AA，etal.Neonatal basophils stifle the function of early-life dendritic cells to curtail Th1 immunity in newborn mice〔J〕.J Immunol，2015；195(2)：507-18.

5Soleimani M，Jameie SB，Mehdizadeh M，etal.Vitamin D3 influence the Th1/Th2 ratio in C57BL/6 induced model of experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕.Iran J Basic Med Sci，2014；17(10)：785-92.

6龚韶华，石晓兵，包朝鲁.辅助性T细胞1，2及白细胞介素4，12在椎间盘突出症患者髓核组织中的表达〔J〕.中国基层医药，2016；23(9)：1299-320.

7崔 伟，阮学广，王慧明，等.老年骨质疏松症与腰椎间盘突出症的相关性研究〔J〕.放射学实践，2012；27(4)：444-6.

8Wen W，Yang L，Liu S，etal.Reporting quality and effect size comparison in randomized controlled trials of bo′s abdominal acupuncture using CONSORT statement and STRICTA〔J〕.J Tradit Chin Med，2016；36(3)：382-91.

9Hong SJ，Kim DY，Kim H，etal.Resorption of massive lumbar disc herniation on MRI treated with epidural steroid injection：a retrospective study of 28 cases〔J〕.Pain Physician，2016；19(6)：381-8.

10Beculic H，Skomorac R，Jusic A，etal.Impact of timing on surgical outcome in patients with cauda equina syndrome caused by lumbar disc herniation〔J〕.Med Glas，2016；13(2)：136-41.

11Saxena R，Kaur J.Th1/Th2 cytokines and their genotypes as predictors of hepatitis B virus related hepatocellular carcinoma〔J〕.World J Hepatol，2015；7(11)：1572-80.

〔2016-07-26修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

刘绍凡(1976-)，男，副主任医师，主要从事中医骨伤研究。

万锐杰(1984-)，男，主治医师，主要从事中医骨伤研究。

R68

A

1005-9202(2017)17-4341-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.083