解毒散结颗粒《中国药典》2015年版微生物限度检查方法学验证

王洪家

(天津市北辰区药品检验所，天津 300400)

解毒散结颗粒《中国药典》2015年版微生物限度检查方法学验证

王洪家

(天津市北辰区药品检验所，天津 300400)

目的：建立解毒散结颗粒的微生物限度检查方法。方法：对解毒散结颗粒采用《中国药典》2015年版四部“1105、1106、1107”项下方法进行微生物限度检查方法学验证。结果：取1∶10供试液，需氧菌总数采用薄膜过滤法测定，回收率比值均在0.9～1.0；霉菌和酵母菌总数采用常规法测定，回收率比值均为1.0；控制菌测定采用常规法。结论：可采用薄膜过滤法测定解毒散结颗粒需氧菌总数，常规法进行霉菌和酵母菌总数及控制菌检查。

微生物限度，解毒散结颗粒，薄膜过滤法，常规法

药品微生物限度检查是控制药品质量的一项重要检查项目，不同成分对微生物有着不同程度的抑制或杀灭作用。检查药品污染微生物情况，可以有效检验药品的质量。为了能够更真实地反应药品受微生物污染的情况，保证人民群众用药安全，必须按照《中国药典》相关方法对药品进行微生物限度检查方法学验证。《中国药典》2015年版较2010年版在微生物限度检查方法学验证方面有了较大的改动。修订后的微生物限度检查方法与《美国药典》基本一致，也能够更好地与国际接轨，检测结果更具可比性，减少了检测结果的不一致性[1]。在染菌方式上由试验菌最后加入改为配制样品时即加入试验菌，充分模拟了样品受微生物污染的状态[2]。本文通过试验，建立了解毒散结颗粒微生物限度检查验证方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 BXM-30R立式灭菌器、岛津TW223L电子天平、DHG-9075A鼓风干燥箱、GNP-9270隔水式恒温培养箱、FW-SPH-80A生化培养箱。

1.2 培养基 麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、RV沙门增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、肠道菌增菌液体培养基均由青岛高科园海博生物技术有限公司生产，均已通过培养基适用性检查并在使用有效期内，培养基的制备按标示方法制备。

1.3 菌种 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104] (均来源于中国食品药品检定研究院)。

1.4 样品 解毒散结颗粒(天津市北辰区中医医院，规格为10 g)。

2 方法与结果

参照《中国药典》2015年版四部“1105、1106、1107”微生物限度检查法[3]进行验证。

2.1 方法

2.1.1 菌液制备 取经胰酪大豆胨液体培养基35 ℃培养24 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物各1 ml，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液按十倍稀释级稀释至10-5～10-7(每1 ml含菌数不大于100 cfu)的菌悬液，备用。取经沙氏葡萄糖液体培养基25 ℃培养48 h的白色念珠菌的新鲜培养物1 ml，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液按10倍稀释级稀释至10-5(每1 ml含菌数不大于100 cfu)的菌悬液，备用。取经沙氏葡萄糖琼脂培养基25 ℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加入含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将孢子洗脱，然后，吸出孢子悬液，采用双层纱布过滤菌丝的方法，收集孢子悬液至另一无菌试管内作为菌原液，取此菌原液1 ml，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液按十倍稀释级稀释至10-4(每1 ml含菌数不大于100 cfu)的菌悬液，备用。

2.1.2 供试液制备 取样品10 g，加胰酪大豆胨液体培养基稀释至100 ml，混匀，作为1∶10供试液。量取1∶10供试液10 ml，加胰酪大豆胨液体培养基稀释至100 ml，混匀，作为1∶100供试液。

2.1.3 需氧菌总数测定 取“2.1.2”项下1∶10供试液和1∶100供试液各适量，分别加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉5种试验菌各适量，使每1 ml含菌数不大于100 cfu，混匀，静置5 min，使菌种与供试液充分接触，混匀，吸取各染菌供试液1 ml注入平皿中，平行制备2皿，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，待凝；另吸取1∶10供试液1 ml薄膜过滤，用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液200 ml分次冲洗，取膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，于30～35 ℃培养至规定时间，测定试验组菌落数，同法测定菌液组和供试液对照组及稀释剂组菌落数。

2.1.4 霉菌和酵母菌总数测定 取“2.1.2”项下1∶10供试液适量，分别加入白色念珠菌、黑曲霉2种试验菌各适量，使每1 ml含菌数不大于100 cfu，混匀，静置5 min，使菌种与供试液充分接触，混匀，吸取染菌供试液1 ml注入平皿中，平行制备2皿，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，待凝，于20～25 ℃培养至规定时间，测定试验组菌落数，同法测定菌液组和供试品对照组菌落数。

2.1.5 大肠埃希菌检查 取1∶10供试液10 ml置于100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，同时加入大肠埃希菌适量，使其含菌量不大于100 cfu，混匀，32.5 ℃培养18 h。另取规定量大肠埃希菌(不大于100 cfu)，加入100 ml的胰酪大豆胨液体培养基中作为阳性对照组，依相应检查法进行适用性检查。

2.2 回收率测定结果 按公式计算加菌回收率：回收率=[(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数]×100%。按《中国药典》2015年版四部“1105、1106、1107”项下[1]规定进行结果判断，回收率比值应在0.5～2之间。验证结果显示，1∶10供试液需氧菌总数测定枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌回收率比值均为0，其他各菌回收率比值均达到试验要求，1∶100供试液需氧菌总数枯草芽孢杆菌回收率比值为0.3，葡萄球菌回收率比值达到试验要求；采用1∶10供试液1 ml薄膜过滤，需氧菌总数枯草芽孢杆菌回收率比值为0.9，其他各菌回收率比值均达到试验要求。1∶10供试液霉菌和酵母菌总数测定，两种菌回收率均达到试验要求。控制菌检查结果均有菌生长，菌落形态符合相应菌落特征。结果见表1-表5。

表1 1∶10供试液需氧菌总数回收率比值

表2 1∶100供试液需氧菌总数回收率比值

表3 1∶10供试液需氧菌总数薄膜过滤回收率比值

表4 霉菌与酵母菌总数回收率比值

表5 控制菌检查

2.3 试验结果 试验结果表明，解毒散结颗粒可以采用薄膜过滤法测定需氧菌总数，采用常规法测定霉菌和酵母菌总数及控制菌检查。

3 讨论

《中国药典》2015年版与2010年版相比，增加了供试品制备中的稀释液种类，采用胰酪大豆胨液体培养基和胰酪大豆胨琼脂培养基取代了营养肉汤和营养琼脂培养基，用于需氧菌总数检查，采用沙氏葡萄糖琼脂培养基取代了玫瑰红钠培养基检测霉菌与酵母菌总数；将原来的细菌总数检查更名为需氧菌总数检查，这其中就包括了细菌、霉菌、真菌等可在此培养基上生长的微生物；2010年版《中国药典》所使用的培养基对目标菌的选择性强，不能满足所有微生物的生长需要，而2015年版《中国药典》所使用的培养基具有良好的广谱性，对目标微生物生长选择性低，有利于微生物的修复与生长，提高检出率[1]。在控制菌检查上增加了耐胆盐革兰阴性菌检查，简化了大肠埃希菌的检验方法，变更了乙型副伤寒沙门菌的培养基种类，取消了大肠菌群的检查。笔者试验发现，该药品采用2010年版《中国药典》的验证方法，采用离心沉淀加培养基稀释法即可消除其抑菌性，但2015年版《中国药典》取消了离心沉淀法，只采用培养基稀释法不能消除其抑菌性，只能采用薄膜过滤法方可满足试验要求，说明新的验证方法能够更真实的反应药品受微生物污染程度。

1 李趣嫦，江艳芳. 《中国药典》2010版与2015版微生物限度检查法对四种药物检测结果的比较[J].中国药品标准，2015,16(2)：86-90

2 李伟. 睾酮凝胶微生物限度检查方法适用性试验的研究[J].天津药学，2015,27(4)：24-26

3 中国药典[S].四部.2015：140-151

2016-05-19

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1006-5687(2016)04-0017-03